鄭元正，謝建亮，孫鸝，王佩飛

（1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬樂清醫(yī)院 外科，浙江 溫州 325600；2.杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院 中心實驗室，浙江 杭州 310036）

有研究表明，細(xì)胞周期調(diào)控異常與細(xì)胞癌變密切相關(guān)，細(xì)胞周期的關(guān)鍵是G1期的啟動，因此對腫瘤的研究多集中在G1～S期[1]。S期激酶相關(guān)蛋白2（S-phasekinaseassociated protein 2，Skp2）屬于F-box蛋白家族中重要的一員，是細(xì)胞周期G1/S期的重要調(diào)控因子，通過泛素化參與細(xì)胞周期調(diào)控，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[2-3]。但Skp2與Cyclin D1的表達(dá)在胃癌中的關(guān)系目前尚不清楚，本研究采用RT-qPCR檢測胃癌組織和正常胃組織中的Skp2、Cyclin D1，探討兩者在胃癌組織和正常胃組織中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 標(biāo)本來源于溫州醫(yī)學(xué)院附屬樂清醫(yī)院2008年9月至2010年10月間內(nèi)鏡室胃鏡活檢的正常胃黏膜組織及經(jīng)外科手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本，均經(jīng)病理證實。正常胃黏膜組織20例，其中男13例，女7例，年齡31～69歲，平均（50.3±4.6）歲。胃癌組織35例，其中男24例，女11例，年齡30～76歲，平均（56.5±6.2）歲；其中早期胃癌15例，進(jìn)展期胃癌20例；高中分化20例，低分化15例；腫瘤未穿透漿膜（T1～T2）22例，穿透漿膜（T3～T4）13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。

1.2 方法 用RT-qPCR法檢測Skp2與Cyclin D1在正常胃組織、胃癌組織中的表達(dá)情況。RNA抽提：每50 mg組織加入1 mL Trizol（購自Gibco公司），按Trizol試劑說明書提取總RNA，測定OD280/260。RT-qPCR所用引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，Oligo dT（購自Takara公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。RT-qPCR檢測反應(yīng)體系包括：1μ L RT產(chǎn)物，1×SYBR Green I Mastermix（購自Takara公司），0.5μmol/L引物。GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min后，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。所有樣品做3個復(fù)孔。記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號到達(dá)所設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值）。公式為：△Ct=標(biāo)本Ct均值-內(nèi)參Ct均值，取2-△Ct代表標(biāo)本初始cDNA相對量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS10.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。Skp2與Cyclin D1表達(dá)以其相對組織的百分比表示，不同標(biāo)本表達(dá)水平的比較采用one-way ANOVA；Spk2與Cyclin D1表達(dá)之間的關(guān)系經(jīng)Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Skp2和Cyclin D1在胃癌中的表達(dá) 胃癌組織和正常胃組織中均檢測到Skp2和Cyclin D1 mRNA，兩者在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常胃組織（分別為F=3.674，P=0.016；F=7.455，P=0.001）（見表1)。低分化胃癌組織的Spk2和Cyclin D1 mRNA表達(dá)明顯高于高中分化程度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.034，P=0.008）（見表2）；而其表達(dá)水平在浸潤程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 Skp2和Cyclin D1 mRNA在胃癌中的表達(dá)（±s）

表1 Skp2和Cyclin D1 mRNA在胃癌中的表達(dá)（±s）

與正常胃組織比：aP<0.05

Skp2 mRNA 0.679±0.381 1.958±0.876a 2.239±0.989a組別正常胃組織早期胃癌進(jìn)展性胃癌例數(shù)20 15 20 cyclin D1 mRNA 0.419±0.324 0.924±0.613a 1.524±1.001a

表2 胃癌組織中Skp2及Cyclin D1 mRNA表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系（±s）

表2 胃癌組織中Skp2及Cyclin D1 mRNA表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系（±s）

病理學(xué)特征分化程度低分化高中分化浸潤程度T1～T2 T3～T4淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)Skp2 mRNA t P Cyclin D1 mRNA t P 15 20 2.238±0.978 1.291±0.789 1.6870.0341.909±1.361 0.786±0.611 2.9770.008 22 13 1.791±0.789 2.018±0.818 1.5730.0651.267±0.834 1.275±0.757 1.5680.071有 無16 19 2.191±0.956 1.918±0.834 1.4650.0791.709±1.028 1.441±0.794 1.4720.078

2.2 Spk2與Cyclin D1表達(dá)之間的關(guān)系 經(jīng)Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Skp2與Cyclin D1之間存在明顯正相關(guān)：r=0.987，P<0.01。

3 討論

Cyclin D1基因位于人染色體12p13區(qū)，其產(chǎn)物Cyclin D1蛋白與CDK4/6形成活性復(fù)合物，參與G1期和S期的pRb磷酸化作用，是細(xì)胞周期正性調(diào)節(jié)蛋白，其異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4]。本研究結(jié)果顯示，Cyclin D1 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于正常胃組織（P<0.05），并且低分化胃癌組織的Cyclin D1 mRNA表達(dá)明顯高于高中分化程度，提示Cyclin D1蛋白的過表達(dá)可能參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。但是，Cyclin D1過表達(dá)與胃癌臨床病理特征關(guān)系的分析結(jié)果顯示，Cyclin D1過表達(dá)與腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性。

Skp2蛋白是細(xì)胞周期G1期到S期轉(zhuǎn)換密切相關(guān)的關(guān)鍵性調(diào)控因子，在G1末期出現(xiàn)，S期前達(dá)到高峰，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[5]。已有研究表明，在多種人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)Skp2蛋白呈高表達(dá)，如結(jié)腸直腸癌、宮頸癌、口腔鱗癌、胃癌、肺癌等，并發(fā)現(xiàn)Skp2表達(dá)水平高低與腫瘤的惡性程度及預(yù)后相關(guān)[6-8]。本實驗結(jié)果顯示，Skp2在胃癌組織中的表達(dá)量明顯高于正常胃組織中的表達(dá)量，并且低分化胃癌組織的Skp2 mRNA表達(dá)明顯高于高中分化程度，表明細(xì)胞的增殖、癌變可能與Skp2的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Skp2與Cyclin D1的表達(dá)存在正相關(guān)，Skp2的高表達(dá)，可能導(dǎo)致了Skp2底物降解的紊亂，促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S轉(zhuǎn)換“關(guān)卡”的作用，使本來應(yīng)該停止增殖的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，促進(jìn)DNA的復(fù)制、細(xì)胞的增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[9]。Skp2和Cyclin D1在胃癌中表達(dá)上調(diào)，提示Skp2和Cyclin D1可能協(xié)同參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，此發(fā)現(xiàn)為胃癌的診治提供了新的思路和依據(jù)。

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