范旻浩， 李婷， 張群嶺，胡夕春

內(nèi)皮特異性分子1(endothelial specific molecule-1，ESM-1)，也稱(chēng)為endocan，作為一種由內(nèi)皮細(xì)胞分泌的可溶性產(chǎn)物，最初是由Lassalle等人于1996年在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的 cDNA文庫(kù)克隆時(shí)意外發(fā)現(xiàn)的，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其在肺組織和腎組織來(lái)源的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。近年來(lái)研究顯示，ESM-1可能通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與體內(nèi)的炎癥反應(yīng)、血管生成以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等病理生理過(guò)程，并在腫瘤預(yù)后、抗血管藥物療效預(yù)測(cè)等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 ESM-1的基因結(jié)構(gòu)

ESM-1由人類(lèi)5號(hào)染色體5q11.2上的單一基因編碼，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。1號(hào)外顯子長(zhǎng)362bp，2號(hào)長(zhǎng)150bp，3號(hào)長(zhǎng)1560bp。其中1號(hào)和部分2號(hào)外顯子編碼一個(gè)含有110個(gè)氨基酸，并且富含半胱氨酸的氨基末端。2號(hào)外顯子同時(shí)編碼一個(gè)富含F(xiàn)(113FPFFQY118)的特殊區(qū)域，該區(qū)域被認(rèn)為與ESM-1的功能密切相關(guān)。最大的3號(hào)外顯子編碼ESM-1蛋白羧基端33個(gè)氨基酸區(qū)域，該區(qū)域含有提前終止密碼子和137位絲氨酸上的O-糖基化位點(diǎn)。

2 ESM-1的基因產(chǎn)物與表達(dá)調(diào)控

2.1 ESM-1的分子結(jié)構(gòu) ESM-1是一種分子量50 kDa的由內(nèi)皮細(xì)胞分泌的可溶性硫酸皮膚素蛋白多糖(dermatan sulphate proteoglycan，DSPG)。完整的ESM-1分子包含165個(gè)氨基酸的核心蛋白以及以共價(jià)鍵的形式連接在第137位絲氨酸殘基上的一條黏多糖單鏈，即硫酸皮膚素鏈。硫酸皮膚素是由N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(iduronate，IdoA)二糖重復(fù)單位構(gòu)成的線性多糖。其中艾杜糖醛酸成分是ESM-1的重要功能結(jié)構(gòu)。現(xiàn)已有的多項(xiàng)研究在健康志愿者、膿毒癥患者及腫瘤患者的血清和組織標(biāo)本中檢測(cè)到以蛋白多糖形式存在的ESM-1［1-4］。對(duì)于研究者來(lái)說(shuō)，以HUVEC為代表的血管內(nèi)皮細(xì)胞模型ESM-1的表達(dá)量很低，往往不能滿(mǎn)足科研需要，Sarrazin等［3］通過(guò)基因重組建立的人體腎臟胚芽細(xì)胞模型(HEK293)，能夠長(zhǎng)周期高水平表達(dá)具備DS活性鏈的ESM-1蛋白聚糖分子，其ESM-1產(chǎn)量超過(guò)傳統(tǒng)細(xì)胞模型60倍(174.3 ± 49.7 μg/mL vs.2.9 ±1.1 μg/mL)，這一成果為深入研究ESM-1以及其他新近發(fā)現(xiàn)的糖基化細(xì)胞因子提供了條件。

2.2 ESM-1的選擇性表達(dá) 基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的選擇性剪切使編碼ESM-1的基因能產(chǎn)生兩種截然不同的表達(dá)產(chǎn)物:一種是成熟的ESM-1分子，包含完整的核心蛋白、F113和F116位的苯丙氨酸富集區(qū)以及硫酸皮膚素黏多糖單鏈。ESM-1的促癌作用主要與黏多糖單鏈和苯丙氨酸富集區(qū)相關(guān);另一種產(chǎn)物較正常的ESM-1分子缺少了2號(hào)外顯子區(qū)域，稱(chēng)之為 endocanΔ2。Depontieu 等［5］的 研 究顯 示endocanΔ2不具備促腫瘤生長(zhǎng)的作用，具體表現(xiàn)在:與ESM-1相比，endocanΔ2多肽鏈與硫酸皮膚素黏多糖單鏈(DS鏈)的結(jié)合率下降(47.4%;95%CI:42.9% ～50.2%)，其作用下的裸鼠移植瘤體積更小(0.04 cm3vs.1 cm3)，在非小細(xì)胞肺癌組織中未能檢測(cè)到其含量的升高。這項(xiàng)研究明確ESM-1基因2號(hào)外顯子所編碼的苯丙氨酸富集區(qū)以及含艾杜糖醛酸的硫酸皮膚素鏈?zhǔn)荅SM-1的主要功能區(qū)域。基因的選擇性剪切也許是ESM-1功能調(diào)節(jié)機(jī)制的一部分。

2.3 ESM-1的表達(dá)調(diào)控 ESM-1表達(dá)水平受一系列炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子調(diào)控。許多炎性介質(zhì)，如腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1等均能促使ESM-1高表達(dá)。Sarrazin等［6］的研究顯示，ESM-1基因表達(dá)水平可受革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上的脂多糖(LPS)上調(diào)。在體外試驗(yàn)中，加入腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1和(或)細(xì)菌脂多糖后，內(nèi)皮細(xì)胞分泌ESM-1的水平上升，這種上升可持續(xù)72 h以上［7］。嚴(yán)重膿毒癥患者血清ESM-1水平尤其高，提示血清ESM-1表達(dá)水平和炎性因子釋放相關(guān)［8］。研究發(fā)現(xiàn)ESM-1表達(dá)水平和某些血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-A、成纖維生長(zhǎng)因子FGF-2之間有較強(qiáng)的相關(guān)性。Aitkenhead等［9］利用 cDNA探針和Northern blot發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞在VEGF和FGF-2刺激下ESM-1基因表達(dá)水平上升了4倍。其可能的機(jī)制是，ESM-1的DS鏈與FGF-2結(jié)合并且促進(jìn)FGF-2依賴(lài)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致新生血管形成。而 VEGF-A通過(guò)3-磷酸肌醇激酶(phospho inositide 3-kinase，PI3K)-Akt信號(hào)通路上調(diào)ESM-1的表達(dá)［10］。目前發(fā)現(xiàn)其他對(duì)ESM-1有肯定上調(diào)作用的因子還包括蛋白激酶C激活劑、維甲酸、核因子κB、VEGF-C等。

3 ESM-1的作用機(jī)制

3.1 激活肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/離散因子轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/離散因子(hepatocyte growth factor/scatter factor，HGF/SF)是一種間葉細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)內(nèi)皮和上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及分化，被認(rèn)為與胚胎時(shí)期器官的形成有關(guān)，異常表達(dá)時(shí)則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［11］。IdoA在ESM-1和HGF/SF的特異性聯(lián)系過(guò)程中扮演了重要角色。IdoA與HGF/SF結(jié)構(gòu)中的O-硫酸己糖胺結(jié)合，這種結(jié)合對(duì)HGF酪氨酸受體C-met的活化及其介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路極其重要，C-met作為HGF的唯一受體蛋白，由原癌基因C-met編碼，被激活后導(dǎo)致ras/致分裂素激活蛋白激酶、PI3K/蛋白激酶B等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的級(jí)聯(lián)激活，使細(xì)胞發(fā)生一系列的生物學(xué)效應(yīng)，如分散、侵襲、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞遷移，最終與腫瘤發(fā)生、腫瘤血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。

3.2 抑制腫瘤免疫監(jiān)控 正常機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞具有監(jiān)控和殺滅作用，這一作用通常由T細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用完成，而T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的接觸往往需要通過(guò)血管內(nèi)皮屏障。ESM-1抑制淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞粘附分子1(ICAM-1)和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)性抗原1(LFA-1)間的相互作用，ESM-1 DS鏈上的硫酸根結(jié)合位點(diǎn)與LFA-1相互作用，改變后者構(gòu)型，干擾LFA-1與ICAM-1的結(jié)合，從而抑制LFA-1介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞功能。譬如淋巴細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮的粘附以及跨內(nèi)皮細(xì)胞遷徙，干擾淋巴細(xì)胞的歸巢和聚集，阻斷T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的接觸通路。這一機(jī)制同樣影響了自然殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤的結(jié)合殺傷，De Freitas等［12］研究發(fā)現(xiàn) ESM-1劑量相關(guān)地對(duì)NK細(xì)胞在內(nèi)皮中遷徙起抑制作用。

3.3 促進(jìn)腫瘤血管和淋巴管生成 成纖維生長(zhǎng)因子FGF-2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF是血管內(nèi)皮增殖、萌芽、成型過(guò)程中的特異性刺激因子。如前所述，ESM-1的DS鏈能與FGF-2結(jié)合并促進(jìn)FGF-2依賴(lài)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，VEGF-A則通過(guò)PI3KAkt信號(hào)通路調(diào)節(jié)ESM-1的表達(dá)。體外研究顯示，ESM-1能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，Gerritsen等［13］發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)中的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，F(xiàn)GF-2、VEGF-A/C、HGF等與ESM-1呈正反饋式地相互促進(jìn)表達(dá)，與此同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生更為明顯，且更易形成管狀結(jié)構(gòu)。然而，單獨(dú)加入ESM-1則對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能無(wú)影響［14］。另外，ESM-1對(duì)淋巴管形成也有促進(jìn)作用，Shin等［15］分別用細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠體內(nèi)試驗(yàn)的方式證明ESM-1和VEGF-A、VEGF-C可相互促進(jìn)，共同引起淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷徙，而單獨(dú)存在ESM-1或VEGF-A/C時(shí)則無(wú)類(lèi)似效果。這同樣驗(yàn)證了ESM-1促血管淋巴管生成作用需要間接通過(guò)FGF-2、VEGF來(lái)實(shí)現(xiàn)。

4 ESM-1的應(yīng)用價(jià)值

4.1 腫瘤血管生成標(biāo)志 腫瘤的生長(zhǎng)有賴(lài)于血供營(yíng)養(yǎng)，血管生成在富血管腫瘤，如腎細(xì)胞癌、肺癌、成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［16-17］。腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為不同于正常血管內(nèi)皮，往往是雜亂的、連接松散的、出芽分枝豐富的、錯(cuò)亂的蜂窩狀血管墻。找到一種能夠特異性反映腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的生物標(biāo)志物，尤其是當(dāng)針對(duì)腫瘤細(xì)胞本身的標(biāo)志物缺乏或應(yīng)用抗血管靶向藥物時(shí)，就顯得十分必要。

目前已存在多種對(duì)血管生成具有預(yù)測(cè)作用的生物標(biāo)志物，包括組織學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)，如微血管密度(microvessel density，MVD)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(sVEGFR)等。但這些標(biāo)志物無(wú)法全面并特異地反映腫瘤新生血管情況，且取材困難。而ESM-1在各種體外培養(yǎng)增殖中的血管內(nèi)皮細(xì)胞，包括冠狀動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、毛細(xì)血管來(lái)源的內(nèi)皮中都有高表達(dá)，而在富含血管的大腦、肝臟、心臟等器官標(biāo)本中卻無(wú)表達(dá)上調(diào)［9］，提示ESM-1并不在休眠期的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，因而可以特異性反映內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性。Almog等［18］在一項(xiàng)包含乳腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、骨肉瘤和脂肪肉瘤的裸鼠移植瘤模型研究中驗(yàn)證了潛伏期腫瘤向高增殖富血管腫瘤轉(zhuǎn)化和ESM-1基因表達(dá)水平的高度相關(guān)性，在所有測(cè)試的髙增殖富血管腫瘤系中ESM-1水平均顯著上升，特別在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和脂肪肉瘤中，ESM-1基因表達(dá)水平增加了30倍。Depontieu等［5］和Recchia等［19］用腎胚芽細(xì)胞293和視網(wǎng)膜血管所做的動(dòng)物模型也分別顯示ESM-1的上升能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成。

通過(guò)基因原位雜交、免疫組化等方法，研究者們陸續(xù)在多種組織器官來(lái)源的腫瘤中發(fā)現(xiàn)ESM-1基因及其產(chǎn)物過(guò)表達(dá)現(xiàn)象。Grigoriu等［7］用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法分析24例非小細(xì)胞肺癌患者的手術(shù)標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)相對(duì)周邊正常組織，腫瘤組織ESM-1-mRNA上升了2.5 倍(P=0.029)。Leroy 等［4］通過(guò)免疫組化分析44例腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤標(biāo)本，其中40例出現(xiàn)ESM-1高表達(dá)，主要表達(dá)部位在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)其中14例患者血清ESM-1水平較正常對(duì)照上升了3～10倍。Buckanovich等［20］也使用基因探針?lè)治雎殉舶┠[瘤血管相關(guān)因子時(shí)證實(shí)ESM-1基因相對(duì)正常組織高表達(dá)。而免疫學(xué)查找胞漿ESM-1的方法則證實(shí)肺、腦、肝、腎來(lái)源的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿ESM-1水平升高［10，14，21-22］。然而，Zuo 等［23］的研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸腺癌組織中ESM-1的表達(dá)反而下降，mRNA及其產(chǎn)物的表達(dá)率分別是36.1%和33.3%，而正常對(duì)照組織中相應(yīng)數(shù)值是70.4%和92.6%。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)ESM-1表達(dá)水平與年齡、性別、臨床分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況都無(wú)關(guān)，但和腫瘤的分化程度正相關(guān)，即分化越好，ESM-1水平越高。同樣的情況在胃腺癌中也有出現(xiàn)，Zhang等［24］發(fā)現(xiàn)胃腺癌組織較正常組織ESM-1表達(dá)下降(30.1%vs.58.5%，P＜0.05)，且與分化程度正相關(guān)。消化道腫瘤這一有別于大多數(shù)情況的研究結(jié)論如能被反復(fù)證實(shí)，也許有助于深入揭示ESM-1在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所扮演的角色。

鑒于血管生成是腫瘤增殖進(jìn)展的因素之一，ESM-1作為血管生成相關(guān)因子，自然被看做是潛在的預(yù)后指標(biāo)。van't Veer等［25］在使用基因芯片分析78例乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，預(yù)后好(5年內(nèi)無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)的35例患者ESM-1基因高表達(dá)的比例為5/35，預(yù)后差的43例患者這一數(shù)值則為18/43，這一研究共包含70項(xiàng)被認(rèn)為與乳腺癌預(yù)后可能相關(guān)的基因。Grigoriu等［7］對(duì)30例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，總生存期(overall survival，OS)與血清 ESM-1 水平(P=0.013)、腫塊大小(P=0.011)、淋巴結(jié)分期(P=0.03)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況(P=0.002)有關(guān)，而與性別、年齡、組織學(xué)類(lèi)型(鱗癌、腺癌等)無(wú)關(guān)。血清ESM-1水平低于和高于1.3 ng/mL的兩組患者中位總生存期有明顯差異(6個(gè)月vs.3個(gè)月)。但COX分析顯示只有當(dāng)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況不納入考慮時(shí)ESM-1才是OS的預(yù)測(cè)因子，因此認(rèn)為ESM-1升高并非是NSCLC獨(dú)立預(yù)后因子，TNM分期依舊是NSCLC最主要的生存預(yù)后因子。Huang等［22］對(duì)90例肝細(xì)胞癌(HCC)患者的研究中，將ESM-1標(biāo)記的微血管密度(ESM1-MVD)作為觀察指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)低ESM1-MVD組1、2、3年生存率比高 endocan-MVD 組都高(77.0%，42.7%，33.7%vs.47.6%，12.8%，0%;P ＜0.01)。同時(shí)多變量分析還顯示ESM1-MVD是HCC患者總生存的獨(dú)立預(yù)后因素(HR=3.31)。

4.2 抗腫瘤血管生成靶向治療預(yù)測(cè)因子 如前所述，ESM-1的表達(dá)隨VEGF的上調(diào)而上調(diào)，因而可以作為一種潛在的反映抗VEGF-VEGFR通路藥物活性的檢測(cè)指標(biāo)。Grigoriu等［7］在體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞上所做的研究顯示，加入抗VEGF抗體后，可劑量依賴(lài)性地抑制VEGF介導(dǎo)的ESM-1表達(dá)水平，當(dāng)抗體劑量達(dá)到0.1 μg/mL時(shí)ESM-1表達(dá)幾乎被完全抑制(95%)。而抗 VEGF受體類(lèi)藥物也可下調(diào)ESM-1。Hardwick等［26］通過(guò)基因芯片的方法發(fā)現(xiàn)，接受VEGF受體2酪氨酸激酶抑制劑處理后ESM-1基因被顯著抑制。Leroy等［4］在體外培養(yǎng)的 VEGF誘導(dǎo)下的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中加入舒尼替尼后，ESM-1的表達(dá)水平下降(IC50=5 ng/mL)。體內(nèi)方面，ESM-1作為藥物療效預(yù)測(cè)指標(biāo)的臨床研究尚不多見(jiàn)，值得一提的是Hatfield等［27］于2011年在對(duì)40例急性髓性白血病(AML)的研究中將ESM-1做為主要觀察指標(biāo)，發(fā)現(xiàn):(1)AML患者血清ESM-1水平相比對(duì)照組有明顯升高，平均為0.7 ng/mL，最高6.8 ng/mL，而對(duì)照組(21名健康志愿者)最高為0.2 ng/mL;(2)經(jīng)過(guò)阿糖胞苷強(qiáng)化治療后患者血清ESM-1水平顯著下降(Wilcoxon’s test，P=0.0004);(3)合并感染的患者血清ESM-1水平上升(P=0.003);(4)ESM-1并非腫瘤細(xì)胞本身所分泌，因?yàn)轶w外培養(yǎng)的AML細(xì)胞并無(wú)ESM-1表達(dá)，且治療期間ESM-1水平變化與骨髓AML細(xì)胞增殖情況無(wú)關(guān)。實(shí)體瘤方面，Zhang等［24］用 RT-PCR和Western blot的方法分析經(jīng)褪黑素處理的胃腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ESM-1表達(dá)上調(diào)，但這一研究仍然停留在體外水平。

由上可見(jiàn)，體外內(nèi)皮細(xì)胞ESM-1的釋放可被抗VEGF/VEGFR藥物所調(diào)節(jié)，同時(shí)，血清ESM-1水平與性別、年齡、遺傳特征、細(xì)胞形態(tài)等個(gè)體差異無(wú)關(guān)。故ESM-1也許可以作為反映腫瘤對(duì)抗VEGF/VEGFR類(lèi)藥物療效的標(biāo)志物。但其血清水平受機(jī)體感染、骨髓激活等諸多臨床常見(jiàn)混雜因素影響，作為預(yù)測(cè)因子時(shí)須注意排除此類(lèi)因素的干擾。

5 結(jié)語(yǔ)

ESM-1通過(guò)抑制激活HGF介導(dǎo)的原癌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，腫瘤免疫監(jiān)控，與VEGF、FGF-2等協(xié)同促進(jìn)腫瘤血管和淋巴管增生，起到促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用?，F(xiàn)有的反應(yīng)血管增生的指標(biāo)，如MVD、VEGF等，無(wú)法全面并特異地反映腫瘤新生血管情況。ESM-1不在休眠期的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，因而可以反映內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性，對(duì)于富血管腫瘤的生長(zhǎng)情況具有預(yù)測(cè)價(jià)值。同時(shí)ESM-1的表達(dá)水平與VEGF的相關(guān)性，提示其可以作為一種潛在的反映抗VEGFVEGFR通路藥物活性的檢測(cè)指標(biāo)，未來(lái)應(yīng)充實(shí)其臨床應(yīng)用方面的研究。鑒于ESM-1能夠通過(guò)多種途徑促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，開(kāi)發(fā)相應(yīng)的靶向治療藥物也許能提供腫瘤治療的新手段。

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