劉勝榮， 刁 平，黃曉紅

AFP在肝癌患者血清中的陽(yáng)性率為70%～80%。原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)血清中的AFP水平高低與肝細(xì)胞癌分化程度有關(guān)，并且其分布曲線(xiàn)呈兩頭低中間高。AFP的檢測(cè)不僅有助于原發(fā)性肝癌的診斷，而且可以作為原發(fā)性肝癌的療效考核標(biāo)準(zhǔn)，但并不能準(zhǔn)確判斷預(yù)后。原發(fā)性肝癌病理切片中的AFP表達(dá)與其血清AFP值之間是否存在聯(lián)系尚不明確，AFP在病理組織中的表達(dá)強(qiáng)弱與預(yù)后的關(guān)系也未見(jiàn)報(bào)道。本課題通過(guò)對(duì)AFP在肝癌組織中的表達(dá)與血清AFP值關(guān)系以及與病理特點(diǎn)、預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行研究，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)108例原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織、76例癌旁組織、10例正常肝組織AFP表達(dá)情況，結(jié)合有術(shù)前血清AFP檢測(cè)值的61例患者進(jìn)行比較研究，以探討AFP與原發(fā)性肝癌生物學(xué)行為的關(guān)系及組織和血清AFP表達(dá)的相關(guān)性對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞癌預(yù)后的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料 肝癌組織108例為2000年1月至2004年12月萊陽(yáng)衛(wèi)校醫(yī)院、萊陽(yáng)中心醫(yī)院進(jìn)行肝癌切除術(shù)的標(biāo)本，其中萊陽(yáng)衛(wèi)校醫(yī)院31例，萊陽(yáng)中心醫(yī)院77例;男87例，女21例;年齡32～70歲，平均年齡54.56歲。所選病例均經(jīng)病理證實(shí)為原發(fā)性肝癌，且術(shù)前均未行全身或局部化療。癌旁肝硬化組織選自76例肝癌旁存在肝硬化的標(biāo)本，另選擇10例同期因膽道手術(shù)切除的部分正常肝組織為正常對(duì)照組織。所有病例均有完整隨訪(fǎng)資料，隨訪(fǎng)手術(shù)后存活時(shí)間，死亡時(shí)間為最后隨訪(fǎng)日期，即為終點(diǎn)。一直存活的患者，腫瘤未復(fù)發(fā)者存活時(shí)間增加12個(gè)月，復(fù)發(fā)患者存活時(shí)間增加6個(gè)月計(jì)算。

1.2 方法 采用免疫組化S-P法，AFP單克隆抗體、S-P免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新公司。將濃縮型AFP單克隆抗體按1∶200最佳稀釋度稀釋。染色步驟:常規(guī)石蠟切片脫蠟逐級(jí)乙醇入水;PBS沖洗5 min×3次;擦干切片周?chē)嘤嘁后w;3%過(guò)氧化氫甲醛溶液處理，室溫下于濕盒內(nèi)作用20 min;PBS沖洗5 min×3次;滴加適當(dāng)稀釋的動(dòng)物非免疫血清，室溫下于濕盒內(nèi)作用20 min，作用完畢后傾去多余血清液體，不沖洗;滴加AFP單克隆抗體，室溫下濕盒內(nèi)作用60 min;PBS沖洗5 min×3次;滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫下于濕盒內(nèi)作用20 min;PBS沖洗5 min×3次;滴加SP復(fù)合物，室溫下于濕盒內(nèi)20 min;PBS沖洗5 min×3次;滴加新配制的DAB顯色劑，室溫下5 min，鏡下觀(guān)察出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果且背景清晰時(shí)即可終止染色;自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。同時(shí)用PBS代替一抗作染色的陰性對(duì)照，用已知的陽(yáng)性染色切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷 光鏡下胞漿染為淡黃至棕黃，為AFP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。綜合考慮切片中陽(yáng)性細(xì)胞占所觀(guān)察同類(lèi)細(xì)胞數(shù)的百分比和陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度兩項(xiàng)指標(biāo)，半定量判定結(jié)果。根據(jù)細(xì)胞染色程度進(jìn)行4級(jí)評(píng)分:無(wú)色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。每例隨機(jī)選取不重復(fù)5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞所占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分比，根據(jù)切片中陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行5級(jí)評(píng)分:陰性0分，0＜陽(yáng)性細(xì)胞＜25%為1分，25%≤陽(yáng)性細(xì)胞＜50%為2分，50%≤陽(yáng)性細(xì)胞＜75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞≥75%為4分。采用二次計(jì)分法，將染色程度得分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比得分相乘，0≤乘積＜3為陰性(－)，3≤乘積＜6為弱陽(yáng)性(+)，6≤乘積＜9為中陽(yáng)性(++)，乘積≥9為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，陰性和弱陽(yáng)性為低表達(dá)，中陽(yáng)性為中表達(dá)，強(qiáng)陽(yáng)性為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。定量資料根據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布與否，采用描繪，并行t檢驗(yàn)(正態(tài)分布)。定性資料采用率或構(gòu)成比描繪，并行χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。3組生存時(shí)間采用Newman-Keuls檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中AFP的表達(dá)情況 AFP定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)染色為淡黃色至棕褐色。

2.2 AFP在HCC不同病理分級(jí)中的表達(dá) 根據(jù)Ednondson分級(jí)，HCCⅠ級(jí)50例中，AFP表達(dá)76%(38/50);Ⅱ級(jí)34例中，AFP表達(dá)76.5%(26/34);Ⅲ/Ⅳ級(jí)24例中，AFP表達(dá)8.3%(2/24)。中分化腫瘤組織AFP表達(dá)最強(qiáng)，高分化稍低，低分化腫瘤組織中AFP的表達(dá)最低。三者之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 HCC組織AFP的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤病理分級(jí)的關(guān)系

2.3 癌組織、癌旁組織與正常肝組織中AFP表達(dá)的比較 癌組織中AFP的表達(dá)占61.1%(66/108)，癌旁組織表達(dá)占100%(76/76)，正常肝組織表達(dá)(0/10)，三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 AFP表達(dá)強(qiáng)度與患者預(yù)后 108例肝癌組織中AFP的表達(dá)強(qiáng)度及對(duì)應(yīng)預(yù)后平均生存時(shí)間見(jiàn)表2，顯示AFP低表達(dá)者術(shù)后平均生存時(shí)間最短，腫瘤組織中AFP中表達(dá)者術(shù)后平均生存時(shí)間最長(zhǎng)，腫瘤組織中AFP高表達(dá)者術(shù)后平均生存時(shí)間介于以上兩組之間。3組生存時(shí)間采用Newman-Keuls檢驗(yàn)，AFP低表達(dá)組生存時(shí)間短于中、高表達(dá)組(P＜0.05)，而中、高表達(dá)組間生存時(shí)間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

表2 原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中AFP表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

2.5 肝癌組織與血清中AFP關(guān)系 將有術(shù)前血清AFP檢測(cè)值的61例患者癌組織的AFP表達(dá)情況和術(shù)前血清AFP檢測(cè)值描記成曲線(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，癌組織中AFP表達(dá)與血清中AFP含量關(guān)系基本成正相關(guān)，曲線(xiàn)不完全一致，但大體走勢(shì)相同，呈兩頭低中間高(見(jiàn)圖1)。

圖1 HCC組織中AFP表達(dá)與血清AFP含量的關(guān)系

2.6 肝癌組織AFP表達(dá)與腫瘤大小的關(guān)系 由表3可見(jiàn)，AFP表達(dá)與腫瘤大小無(wú)關(guān)(P＞0.05)。

表3 原發(fā)性肝細(xì)胞癌的AFP表達(dá)與腫瘤大小的關(guān)系

3 討論

血清AFP檢測(cè)用于HCC的篩查首選已成共識(shí)。檢測(cè)方法有放射免疫法(RIA)和AFP單克隆抗體酶免法(EIA)快速測(cè)定法，陽(yáng)性率為70% ～80%，用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定陽(yáng)性率平均為76.2%。一般認(rèn)為AFP＞400 μg/L時(shí)可對(duì)原發(fā)性肝癌確定診斷。臨床上對(duì)于原發(fā)性肝癌的高危人群，若血清AFP顯著升高，持續(xù)時(shí)間大于2個(gè)月，影像資料無(wú)論有無(wú)肝內(nèi)占位病變，都應(yīng)高度警惕存在原發(fā)性肝癌的可能，應(yīng)給密切觀(guān)察，因?yàn)檠錋FP的陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)往往早于癥狀出現(xiàn)8～11個(gè)月［1］。肝細(xì)胞肝癌血清中的AFP水平高低與肝癌細(xì)胞分化程度有關(guān)，Ⅰ級(jí)肝癌細(xì)胞分化接近正常細(xì)胞，故AFP含量尚不足以測(cè)出，Ⅳ級(jí)由于分化極差，已失去類(lèi)似胚胎細(xì)胞的機(jī)能，也不能從血清中檢出AFP，Ⅱ、Ⅲ級(jí)肝癌細(xì)胞認(rèn)為是和胚胎肝細(xì)胞相似的幼稚細(xì)胞，產(chǎn)生AFP陽(yáng)性率較高，因此肝細(xì)胞癌的分化程度不同，AFP含量存在差異。但有15%左右的原發(fā)性肝癌患者血清中AFP始終不高，故AFP不高者并不能排除原發(fā)性肝癌。

國(guó)外有報(bào)道AFP在HCC組織中的陽(yáng)性率在44%～70%之間，常呈灶狀分布。在細(xì)胞內(nèi)的分布以核周型為主，也可表現(xiàn)為胞質(zhì)型、胞膜型和局限型，其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和免疫組化反應(yīng)強(qiáng)度大多與AFP血濃度、肝細(xì)胞癌的分化程度相關(guān)［2-5］。Niwa等［2］報(bào)道AFP mRNA水平在30例HCC的癌腫區(qū)比非癌區(qū)增加大約10～105倍，并且與血清AFP水平和腫瘤的大小均相關(guān)。Ohguchi等［3］也報(bào)道AFP的血清水平越高，表達(dá)它的HCC細(xì)胞群越大，在癌周組織中AFP僅有弱表達(dá)，而正常肝組織中為陰性。國(guó)內(nèi)的一項(xiàng)研究［6］結(jié)果表明，AFP在HCC組織中的表達(dá)有以癌巢分布的趨勢(shì)，雖然在肝硬化和癌周組織的部分細(xì)胞也可見(jiàn)AFP表達(dá)，但其陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度均低于HCC組織，且多為核陽(yáng)性，伴不典型增生，提示這些細(xì)胞可能是癌前期細(xì)胞，它們可能已開(kāi)始擁有腫瘤樣生長(zhǎng)能力，但還缺乏惡性轉(zhuǎn)化的表型。AFP的表達(dá)可能和肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)［2］。

囯內(nèi)李偉等［7］針對(duì)40例HCC患者的一項(xiàng)研究證實(shí)，AFP在肝癌內(nèi)的表達(dá)率為87.5%，癌旁組織為80.0%，但其強(qiáng)度反應(yīng)更高，充分說(shuō)明不僅癌細(xì)胞內(nèi)存在AFP，癌旁非癌性組織中也出現(xiàn)了AFP陽(yáng)性顆粒。還有研究表明HCC組織內(nèi)的AFP和癌旁組織的AFP二者的分子結(jié)構(gòu)具有異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為AFP分子中糖基的結(jié)構(gòu)及組成的差異，這種差異與能合成AFP的細(xì)胞特征及細(xì)胞處于不同的病理狀態(tài)有關(guān)，因此肯定HCC周?chē)∽兘M織可出現(xiàn)AFP陽(yáng)性顆粒，從而提示HCC的發(fā)生發(fā)展與慢性肝病特別是肝硬化密切相關(guān)。

本課題發(fā)現(xiàn):(1)肝癌患者的血清AFP檢測(cè)值的高低與其癌組織 AFP的表達(dá)情況基本成正相關(guān)關(guān)系(曲線(xiàn)均為兩頭低中間高)。原因可能是:肝癌細(xì)胞分兩種，一種合成AFP，一種不合成AFP;AFP只在細(xì)胞周期的一定時(shí)期合成，不處于此期的癌細(xì)胞不合成AFP;高分化和明顯低分化癌細(xì)胞很少合成或不合成AFP;癌細(xì)胞嚴(yán)重影響AFP合成;癌組織中纖維間質(zhì)較多，AFP不易進(jìn)入血液。(2)HCC組織中AFP表達(dá)與預(yù)后有關(guān)，AFP表達(dá)高者預(yù)后好，生存時(shí)間較長(zhǎng);反之，預(yù)后差，生存時(shí)間短?，F(xiàn)有的研究尚缺乏類(lèi)似報(bào)道，筆者認(rèn)為，這可能是高表達(dá)腫瘤患者在術(shù)后隨訪(fǎng)時(shí)血液中AFP再次顯著增高往往先于影像學(xué)發(fā)現(xiàn)肝癌復(fù)發(fā)而盡早被發(fā)現(xiàn)從而得到及時(shí)治療有關(guān)。病理分級(jí)較差且AFP低或不表達(dá)，多提示腫瘤呈顯著低或未分化，幾乎不分泌AFP，提示預(yù)后不良。

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