惲 文， 季明華， 李文靜， 李 建， 鐘山亮， 唐金海，趙建華

微小RNA(miRNA)是一類新近發(fā)現(xiàn)的存在于真核細胞中的非編碼小分子RNA，通過下調(diào)蛋白編碼基因的表達而對不同細胞的生長、分化或發(fā)育過程起關(guān)鍵調(diào)控作用。分析細胞或組織樣本中miRNAs的表達可為研究這類分子的生物學功能提供重要的信息。成熟miRNAs片段小，沒有poly(A)尾巴，家族成員間通常只有一兩個堿基的差別，并且在細胞中的表達水平普遍較低，這些特性給miRNA定量檢測方法的建立帶來了困難和挑戰(zhàn)。為此，本文統(tǒng)一采用SYBR Green I的熒光模式，在Li等［1］報道的基礎(chǔ)上建立一種新的基于連接酶依賴性反應(yīng)的miRNA實時定量PCR方法(LDR-qPCR法)，并與莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄的SYBR GREEN實時定量PCR法［2］(莖環(huán)RT-qPCR法)進行比較，希望能為miRNA的研究提供敏感而準確的檢測工具。目前miR-122的研究主要集中在肝臟疾病上，已被認為是一個調(diào)節(jié)肝臟代謝和發(fā)育的“肝特異性miRNA”。不過，最近Sun等［3］通過芯片篩選和RT-qPCR法確認，證實 miR-122a在乳腺癌干細胞中的表達水平較乳腺癌MCF-7細胞明顯增高;靶基因預測分析顯示其潛在靶點涉及腫瘤發(fā)生、DNA修復、細胞周期調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導等多個過程，提示miR-122a很可能是乳腺癌細胞、特別是癌干細胞的重要調(diào)控因子。已知乳腺癌是激素依賴性腫瘤，對雌激素的依賴性最大;其發(fā)生發(fā)展與內(nèi)分泌功能失調(diào)密切相關(guān)，該過程有多種miRNAs參與，如 Wickramasinghe等［4］發(fā)現(xiàn)在乳腺癌MCF-7細胞中，雌二醇可抑制miR-21的表達，這種抑制作用可被內(nèi)分泌治療藥物如他莫昔芬和氟維斯群等阻斷。乳腺癌細胞miR-122a的表達是否也與雌激素調(diào)控有關(guān)，本文亦對此進行初步研究。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細胞株HepG2由南京大學醫(yī)學院遺傳系惠贈;人乳腺腺癌上皮細胞株MCF-7購自中科院上海細胞所;DMEM和無酚紅DMEM購自GIBCO公司;胎牛血清(FBS)和活性碳處理的FBS購自Boind公司;Taq DNA連接酶和Taq酶購自NEB公司;Trizol、cDNA第一鏈合成試劑盒和SYBR Green Mix購自Biouniquer公司;17β-雌二醇購自sigma公司;引物和探針由上海閃晶生物公司合成，PAGE法純化。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光定量PCR儀:配有IQ5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司;超微量紫外分光光度計:配有NanoDrop2000軟件，美國NanoDrop公司;凝膠成像儀:配有141萬像素全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)，上海培清科技有限公司;瓊脂糖水平電泳槽(中號):美國伯樂公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總 RNA的提取 收集對數(shù)期 HepG2或MCF-7細胞，加Trizol提取總RNA;3%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，紫外分光光度儀測定其吸光度(A)，A260/A280 為 1.8 ～2.0，純度符合要求，以A260值計算核酸濃度。

1.3.2 探針和引物的設(shè)計 查詢miRBase數(shù)據(jù)庫獲得成熟hsa-miR-122a序列:5'-UGGAGUGUGA↓CAAUGGUGUUUGU-3'(箭頭為連接反應(yīng)點)。按參考文獻［1］設(shè)計一對含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針和一對引物。探針1的3'端13個堿基和探針2的5'端10個堿基與miR-122a全序列互補并相鄰(粗體標出)，探針1:5'-GGTATCCAGGGAAGTGGATACGAAGAAT GCACAAACACCATTG-OH-3'和探針 2:5'-PO4-TCACACTCCACGCTGTGTTAAAGTCGTACAGGTA TTACGACA-3';上游引物與探針1的部分序列重復，其序列為5'-GGGAAGTGGATACGAAGAATGC-3'，下游引物與探針2的部分序列互補，其序列為5'-CGACTTTAACACAGCGTGGAG-3'。以 U6為內(nèi)對照，同法設(shè)計，探針為5'-TATGGAACGCTTCACGAAT TTGCGTGTCATCCTTGCGCAGGGGCCATGCT-OH-3'和5'-PO4-AATCTTCTCTGTATC-GTTCCAATTTTAGTATATGTGCTGCCGAAGCGAAGA T3';上、下游引物分 別 為 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'和 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3.3 連接反應(yīng) 取總 RNA 1 μg，加入 miR-122a或U6的探針1和探針2各25 fmol進行雜交，反應(yīng)條件為65℃變性3min后緩慢地降至室溫(約45 min);然后加入 1 ×Taq ligase buffer、1 μL RNasin 和

0.4 μL Taq DNA 連接酶，總體積 20 μL 進行連接反應(yīng)，45℃溫浴2 h后，90℃滅活10 min。

1.3.4 LDR-qPCR 法 以 miR-122a或 U6的連接產(chǎn)物為模板，加入相應(yīng)上、下游引物進行實時定量PCR，反應(yīng)體系25 μL，含模板2 μL、2 ×SYBR Green Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL) 各 0.5 μL，去離子水 9.5 μL;反應(yīng)條件為 95 ℃ 變性 10 min，95 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共 40 個循環(huán)，每個循環(huán)于72℃收集熒光;55℃ ～95℃每上升1℃收集一次熒光，繪制溶解曲線。同時設(shè)置HeGp2為陽性對照，水代替模板為陰性對照同步擴增。

1.3.5 莖環(huán) RT-qPCR法 按參考文獻［2］設(shè)計miR-122a的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物:5'-GCGCGTGAGCAGGCTGGAGAAATTAACCACGCGCACAAACAC-3';U6特異逆轉(zhuǎn)錄引物的5'端不必添加延伸序列和莖環(huán)序列，且與下游引物序列相同:AACGCTTCACGAATTTGCGT。miR-122a上游引物:5'-TGGAGTGTGACAATGG-3'，U6上游引物:5'-CGCAAGGATGACACG-3'。miR-122a下游引物:5'-GAGCAGGCTGGAGAA-3'。取總 RNA 1μg，利用 miR-122a 或U6的特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;再以該 cDNA為模板，以 miR-122a或 U6的 PCR上、下游引物分別進行實時定量PCR，并計算miR-122a的相對表達量。

1.3.6 細胞培養(yǎng)及分組處理 (1)MCF-7細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基(A1組)。(2)對數(shù)期MCF-7細胞經(jīng)PBS洗滌后，加入含10%活性碳處理FBS的無酚紅DMEM中進行激素饑餓培養(yǎng)48h(B1組)。(3)以DMSO為溶劑，將終濃度5 nmol/L的17β-雌二醇分別加入常規(guī)培養(yǎng)(A2組)和激素饑餓培養(yǎng)的MCF-7細胞中(B2組)，孵育24 h。每組設(shè)置3份平行。計A1組為校準樣本(miR-122a表達量為 1)，2－ΔΔct法計算各組 miR-122a相對表達量。

1.3.7 LDR-qPCR方法學評價 (1)擴增產(chǎn)物特異性:結(jié)合熔解曲線、3%瓊脂糖凝膠電泳和擴增產(chǎn)物測序，分析其特異性。(2)重復性:以 MCF-7和HeGp2細胞作為待測樣本，每份樣本從總RNA提取開始重復3次，以ΔCt=Ctu6-CtmiR-122a代表各反應(yīng)管檢測結(jié)果，評價檢測反應(yīng)的重復性。(3)檢測范圍和靈敏度:以MCF-7細胞為樣本，10倍倍比稀釋miR-122a的連接產(chǎn)物或cDNA，檢測各稀釋系列樣本。各樣本均設(shè)3個復管。比較LDR-qPCR法與莖環(huán)RT-qPCR法的線性檢測范圍和靈敏度。(4)相關(guān)性:對下述 A1、A2、B1、B2組 MCF-7細胞進行 miR-122a表達量的檢測，分析LDR-qPCR法與莖環(huán)RT-qPCR法的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0軟件進行Paired-t test和雙變量相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 方法學評價

2.1.1 特異性 LDR-qPCR法檢測miR-122a或U6的熔解曲線為單一熔解峰，電泳為單一清晰條帶，且峰值、電泳條帶大小均與陽性對照一致，陰性對照無相應(yīng)熔解峰和條帶(圖1);擴增產(chǎn)物測序與 hsamiR-122a公布序列一致。

圖1 LDR-qPCR法的擴增結(jié)果

2.1.2 重復性 LDR-qPCR法檢測的批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%，與莖環(huán)RT-qPCR法基本相當(表1)。

表1 LDR-qPCR法檢測miR-122a的重復性(± s，n=3)

表1 LDR-qPCR法檢測miR-122a的重復性(± s，n=3)

LDR-qPCR 4.96 ±0.49 9.87 3.18 ±0.29 9.12_莖__環(huán)RT-qPCR____5.87 ±0.54_______9.20________________________3.74_±0.338.86

2.1.3 檢測范圍和靈敏度 各稀釋系列樣本檢測結(jié)果見圖2。LDR-qPCR法與莖環(huán)RT-qPCR法檢測miR-122a的檢測最低限為10－4稀釋度(RNA濃度為5 pg/μL)，莖環(huán) RT-qPCR 法為10－3稀釋度(RNA濃度為50 pg/μL)，前者比后者敏感10倍。

圖2 LDR-qPCR法(上圖)與莖環(huán)RT-qPCR法(下圖)的線性檢測范圍

2.1.4 相關(guān)性 分別用LDR-qPCR法與莖環(huán)RT-qPCR法檢測A1、A2、B1、B2組細胞 miR-122a表達量，二者結(jié)果具有良好的相關(guān)性(r=0.996，P=0.542)。

2.2 雌激素對miR-122a表達的調(diào)節(jié)

經(jīng)LDR-qPCR法檢測，miR-122a表達水平隨著雌激素含量的增加而下調(diào)，呈負相關(guān)(r=－0.960)。激素饑餓培養(yǎng)的MCF-7中miR-122a表達上調(diào)，約為常規(guī)培養(yǎng)細胞的3.65倍;經(jīng)5 nmol/L雌二醇處理后miR-122a的表達又出現(xiàn)明顯下調(diào)(P=0.040)，但未能回到常規(guī)培養(yǎng)細胞水平(圖3)。莖環(huán)RT-qPCR法檢測結(jié)果亦顯示相似的變化趨勢。

3 討論

圖3 LDR-qPCR法(上圖)與莖環(huán)RT-qPCR法(下圖)檢測A1、A2、B1、B2組MCF-7細胞miR-122a表達的結(jié)果

miRNAs種類多、序列短且同源性高，實時定量PCR法需經(jīng)過特殊的設(shè)計或樣本處理才能用于miRNA的檢測，其中Chen等［2］設(shè)計的莖環(huán)RT引物不僅解決了miRNAs短小難以擴增的問題，還可區(qū)分堿基差別在3'端的同家族成員，配合Taqman探針特異性高、費時短等優(yōu)點，是目前檢測miRNAs普遍采用的方法，但成本較高。在本研究中，我們建立了LDR-qPCR法，不需經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程，僅依賴于一對莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針與靶miRNA的特異性雜交以及連接酶的忠實性連接，就能非常特異地識別出序列間的差異;兩探針相連端莖環(huán)結(jié)構(gòu)的設(shè)計能有效地防止靶miRNA序列不存在時探針的自身連接，避免假陽性結(jié)果［1］。擴增產(chǎn)物凝膠電泳和熔解曲線分析僅出現(xiàn)單一條帶或預期熔解峰，測序分析為miR-122a序列，均證明其特異性。如此，在后續(xù)的實時定量PCR過程中只需采用通用型熒光燃料SYBR Green I即可進行信號檢測，大大降低了成本。同時，我們的結(jié)果還顯示此方法重復性好，與莖環(huán)RT-qPCR法檢測結(jié)果具有良好的相關(guān)性(r=0.996)，且檢測范圍更寬、靈敏度更高。

2002年Lagos-Quintana等［5］對小鼠不同組織中的miRNAs進行鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)在其肝臟組織中miR-122高度特異表達，并克隆出其完整的堿基序列，同時在小鼠的肝臟中還克隆出miR-122的亞型，分別是miR-122a和miR-122b，兩者只是在3'末端分別多一個堿基U或A。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，miR-122/122a在人類肝臟中也高度表達，可通過調(diào)控其靶基因的表達參與肝臟的分化和功能維護;實際上最為關(guān)鍵的似乎是調(diào)節(jié)肝臟膽固醇和脂肪酸的代謝［6］;而在肝癌組織或肝癌來源的各種細胞株中表達下調(diào)，是肝癌的一個潛在生物標志［7］。不過，有關(guān)miR-122在肝外腫瘤或細胞株中的表達和功能研究還鮮有報道。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞MCF-7也能表達miR-122a，且其表達量與雌激素水平呈負相關(guān)性:利用活性碳處理的FBS從培養(yǎng)基中去除類固醇激素后發(fā)現(xiàn)，無激素培養(yǎng)MCF-7細胞表達miR-122a明顯上調(diào)，而加入雌二醇后miR-122a的表達又受到抑制，表現(xiàn)為一定程度的下調(diào)。據(jù)報道17β-雌二醇、胰島素以及類胰島素生長因子可作為分裂素促進乳腺癌細胞生長，其機制部分與調(diào)節(jié)脂肪酸合成有關(guān)［8］，而miR-122是脂肪酸代謝的主要調(diào)控因子，由此，我們推測:miR-122可能在無激素環(huán)境下對乳腺癌細胞的生長和生存起重要作用，其中雌激素是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，值得進一步研究。

綜上所述，本研究成功建立了檢測miR-122a的LDR-qPCR法，此方法特異性高，且檢測范圍和靈敏度均優(yōu)于莖環(huán)RT-qPCR法，有推廣應(yīng)用前景;同時我們的研究還發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞也表達miR-122a并受雌激素的調(diào)節(jié)，開辟了miR-122在肝腫瘤外的功能研究，而其具體的功能及激素調(diào)節(jié)機制還有待闡明。

［1］Li J，Yao B，Huang H，et al.Real-time polymerase chain reaction microRNA detection based on enzymatic stem-loop probes ligation［J］.Anal Chem，2009，81(13):5446-5451.

［2］Chen C，Ridzon DA，Gugler KJ，et al.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR［J］.Nucleic Acids Res，2005，33(20):e179.

［3］Sun J，Lian R，Qiu J，et al.Microarray-based analysis of microRNA expression in breast cancer stem cells［J］.Exper Clin Cancer Res，2010，29:174.

［4］Wickramasinghe NS，Manavalan TT，Dougherty SM，et al.Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells［J］.Nucleic Acids Res，2009，37(8):2584-2595.

［5］Lagos-Quintana M，Rauhut R，Yalcin A，et al.Identification of tissue-specific microRNAs from mouse［J］.Curr Biol，2002，(9):735-739.

［6］Esau C，Davis S，Murray SF，et al.miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting［J］.Cell Metab，2006，3(2):87-98.

［7］Diao S，Zhang JF，Wang H，et al.Proteomic identification of microRNA-122a target proteins in hepatocellular carcinoma［J］.Proteomics，2010，10(20):3723-3731.

［8］Menendez JA，Lupu R.Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis［J］.Nat Rev Cancer，2007，7(10):763-777.