劉智群 王梅梅 侯靈彤 張 放 熊亞南 劉 敏 李淑英*

(河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)院，①基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，②附屬醫(yī)院 河北唐山 063000;③唐山市中醫(yī)院)

EB病毒BARF1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

劉智群 王梅梅①侯靈彤②張 放②熊亞南①劉 敏③李淑英①*

(河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)院，①基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，②附屬醫(yī)院 河北唐山 063000;③唐山市中醫(yī)院)

①目的 構(gòu)建攜帶EB病毒(Epstein－Barr virus，EBV)編碼BARF1基因的真核表達(dá)載體。②方法 根據(jù)GenBan提供的BARF1基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物，并在兩端添加酶切位點(diǎn);常規(guī)培養(yǎng)B95－8細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，通過(guò)RT－PCR擴(kuò)增BARF1基因，將其克隆到pUM－T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并用EcoRI和XbaI雙酶切與測(cè)序鑒定，證實(shí)BARF1基因已克隆到pUM－T載體。凝膠回收雙酶切產(chǎn)物BARF1片段，再將其連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)－h(huán)is，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并用EcoRI和XbaI雙酶切分析，確認(rèn)插入方向。③結(jié)果 以B95－8細(xì)胞提取RNA進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增的cDNA為模板擴(kuò)增BARF1，得到與預(yù)期片段大小相符的666bp的片段;對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行鑒定后，證實(shí)目的基因BARF1片段已插入pUM－T載體，經(jīng)雙酶切和測(cè)序分析，確認(rèn)BARF1基因已正確連接到pcDNA3.1(+)－h(huán)is真核表達(dá)載體。④結(jié)論 成功地構(gòu)建真核表達(dá)載體。pcDNA3.1(+)/BARF1 － his。

EB病毒 BARF1基因 真核表達(dá)載體

BARF1是 EB病毒(EPstein－Barr virus，EBV)編碼的BamH I A區(qū)域的早期裂解基因，是近年來(lái)確認(rèn)的EBV新的致癌基因，可促進(jìn)上皮細(xì)胞永生化和轉(zhuǎn)化等功能［1，2］。為探討B(tài)ARF1基因?qū)θ宋干掀ぜ?xì)胞的影響，我們構(gòu)建了攜帶BARF1基因的真核表達(dá)載體。

1 材料與方法

1.1 材料 B95－8細(xì)胞、真核表達(dá)載體 pcDNA3.1(+)－h(huán)is

及感受態(tài)Ecoli DH5α本室保存。pUM－T載體、RNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、RT－PCR試劑盒、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清及2xPower Taq PCR Master Mix均購(gòu)于北京百泰克生物公司;限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI及XbaI購(gòu)于TakaRa生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)GenBank提供的BARF1基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因BARF1的特異性引物，并在引物兩端添加酶切位點(diǎn)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 本研究中使用的擴(kuò)增引物

1.2.2 RT－PCR。常規(guī)培養(yǎng)B95－8細(xì)胞于RPMI1640完全培養(yǎng)液(含10%滅活的小牛血清，100U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)中。提取細(xì)胞RNA(按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)。RT－PCR擴(kuò)增cDNA。

1.2.3 目的基因BARF1的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20uL):2×Power Taq PCR Master Mix 10mmol/L，primer 10 pmol/L(使用引物BARF1#1與2)，加入2μL的cDNA作為模板，加雙蒸水至20μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min，循環(huán)參數(shù)95℃/1min，55℃/1min，72℃ /1min，5 個(gè)循環(huán);95℃ /20s，55℃ /30s，72℃ /30s，35 個(gè)循環(huán);72℃延伸5min;4℃保存。PCR產(chǎn)物在含0.01%Gold View的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。凝膠成像儀照相。

1.2.4 BARF1基因的T－A克隆與鑒定。目的基因BARF1擴(kuò)增產(chǎn)物與pUM－T載體克隆反應(yīng)按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。堿裂解法提取質(zhì)粒;對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定。PCR鑒定方法同1.2.3，引物改為BARF1#3與4。酶切鑒定反應(yīng)體系:T－A克隆質(zhì)粒 5μL，10× Buffer(TangTM)1μL，EcoRI和 XbaI內(nèi)切酶各1μL，無(wú)菌去離子水2μL。置37℃溫箱2小時(shí)后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。委托北京百泰克生物計(jì)劃有限公司測(cè)序。

1.2.5 BARF1真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定。將上述T－A克隆的雙酶切產(chǎn)物BARF1進(jìn)行膠回收(按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)。用EcoRI和XbaI進(jìn)行雙酶切真核載體pcDNA3.1(+)－h(huán)is，反應(yīng)體系:pcDNA3.1(+)－h(huán)is質(zhì)粒 5μL，10×Buffer(TangTM)1μL，EcoRI和 XbaI內(nèi)切酶各1μL，無(wú)菌去離子水 2μL。置 37℃溫箱2小時(shí)后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。并進(jìn)行膠回收。將回收BARF1片段與pcDNA3.1(+)－h(huán)is片段見(jiàn)表2。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α，在含有氨芐青霉素的LB平板中篩選，用含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒;對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

表2 真核載體pcDNA3.1(+)－h(huán)is與BARF1連接體系(20μL)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞RNA提取 將所提RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳得到28S、18S和5S共3條帶見(jiàn)圖1;從圖1可以看出，我們所提RNA較為完整，無(wú)明顯降解現(xiàn)象。

圖1 B95－8細(xì)胞中提取的RNA:圖中B95－8是B95－8細(xì)胞提取的RNA。

圖2 目的基因BARF1基因的擴(kuò)增:圖中M1:100bp的maker，B95－8是目的基因BARF1擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 對(duì)質(zhì)粒1和質(zhì)粒2進(jìn)行BARF1基因擴(kuò)增鑒定:圖中M:23.1kb的λDNA－maker;M1:100bp的maker，質(zhì)粒1與質(zhì)粒2分別是所提的兩個(gè)質(zhì)粒BARF1基因的鑒定。

圖4 對(duì)質(zhì)粒1和質(zhì)粒2雙酶切鑒定:圖中M:23.1kb的λDNA－maker;M1:100bp的maker，質(zhì)粒1與質(zhì)粒2分別是所提的兩個(gè)質(zhì)粒的雙酶切鑒定。

圖5 真核質(zhì)粒雙酶切鑒定:圖中M為λDNA－maker;M1為100bp－maker;1、2、3和4 分別是質(zhì)粒1、2、3和4的雙酶切鑒定。

2.2 目的基因的擴(kuò)增 以RT－PCR所得cDNA為模板擴(kuò)增目的基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到大小約為666bp的片段(圖2)，與我們預(yù)期結(jié)果一致。

2.3 BARF1基因的T－A克隆與鑒定 為了驗(yàn)證目的基因是否已經(jīng)被成功連接到pUM－T原核載體上，我們對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行了BARF1基因的擴(kuò)增鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到大小為524bp的片段(圖3)，與預(yù)期片段大小相一致，說(shuō)明BARF1基因已克隆到pUM－T載體。雙酶切鑒定:為了進(jìn)一步證實(shí)BARF1基因已克隆到pUM－T載體，我們對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，得到3個(gè)不同的片段(圖4)，其大小分別為3.4kb(可能為未被切的質(zhì)粒)、2.7kb(與pUM－T載體大小相一致)及666bp(與插入的目的基因大小一致)。

2.4 BARF1真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 BARF1與真核表達(dá)載體 pcDNA3.1(+)－h(huán)is連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coli DH5α，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選后，對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳得到5.4kb及666bp兩個(gè)片段(圖5)。測(cè)序結(jié)果證實(shí)我們構(gòu)建的攜帶BARF1基因的真核表達(dá)載體完全正確，將其命名為pcDNA3.1(+)/BARF1 － his。

3 討論

EB病毒(Epstein－Barr virus，EBV)是一種致瘤病毒，該病毒DNA以線(xiàn)性雙鏈的構(gòu)型存在，基因組大小為172Kb。BARF1是近年來(lái)確認(rèn)的EBV新的致癌基因，其致癌作用日益受到關(guān)注。李友瓊等［3］將BARF1基因轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SGC7910后，能夠全面增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的腫瘤原性。Sheng等［4］應(yīng)用刪除突變方法研究了BARF1基因中不同區(qū)域?qū)?xì)胞的轉(zhuǎn)化作用，發(fā)現(xiàn)刪除BARF1的N端序列便失去了對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用，此段序列編碼的氨基酸可以激活抗凋亡基因bcl－2的表達(dá)，提示對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是必需的。

由于目前BARF1基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的確切作用尚不清楚，并且在體內(nèi)研究某一單個(gè)基因較為困難，我們將通過(guò)構(gòu)建攜帶BARF1基因的真核表達(dá)載體 pcDNA3.1(+)/BARF1－h(huán)is，建立穩(wěn)定表達(dá)BARF1基因的人胃上皮細(xì)胞系，從而建立BARF1基因致瘤的體外模型，研究BARF1基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中確切作用。

不同的載體，其轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)量均不同;本研究選用真核表達(dá)載體 pcDNA3.1(+)－h(huán)is，因該載體含有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子及SV40復(fù)制起點(diǎn)，啟動(dòng)子啟動(dòng)效率高，宿主細(xì)胞譜廣泛，易于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。通過(guò)構(gòu)建pcDNA3.1(+)/BARF1－h(huán)is載體可實(shí)現(xiàn)對(duì)BARF1基因的分析。

本研究中利用T載體進(jìn)行TA克隆后，通過(guò)EcoRI和XbaI雙酶切，得到帶有雙酶切位點(diǎn)的目的基因片段。為準(zhǔn)確地表達(dá)BARF1基因，我們將TA克隆的目的基因進(jìn)行了測(cè)序分析，確認(rèn)所得目的基因與Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)株的基因序列同源性為99.9%，并與真核表達(dá)載體連接。在確認(rèn)序列正確后，還要保證插入片段方向的正確，這樣才可保證翻譯的蛋白質(zhì)具有相應(yīng)的功能。對(duì)我們所構(gòu)建的真核表達(dá)載體，通過(guò)酶切對(duì)插入的方向進(jìn)行確認(rèn)。由于內(nèi)切酶切割不同的酶切位點(diǎn)可以得到不同大小的片段。我們通過(guò)EcoRI和XbaI雙酶切所構(gòu)建的真核表達(dá)載體，得到與載體pcDNA3.1(+)－h(huán)is和目的基因大小相當(dāng)，約為5.4kb和666bp兩個(gè)片段，說(shuō)明目的基因插入的方向正確。從而為建立穩(wěn)定表達(dá)BARF1基因的人胃上皮細(xì)胞系，研究BARF1的功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

［1］ Seto E，Yang L，Middeldorp J，et al.Epstein Barr virus(EBV)encoded BARF1 gene is expressed in nasopharyngeal carcinoma and EBV－associated gastric carcinoma tissues in the absence of lytic gene expression［J］.J Med Virol，2005，76(1):82

［2］ Fiorini S，Ooka T.Secretion of Epstein Barr virus encoded BARF1 oncoprotein from latently infected B cells［J］.Virol J，2008，5(70):1186

［3］ 李友瓊，張雪怡，曾 健，等.EB病毒BARF1基因表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7910生物學(xué)行為的影響［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009，19(3):214

［4］ Sheng W，Decaussin G，Sumner S，et al.N － terminal domain of BARF1 gene encoded by Epstein－Barr virus is essential for malignant transformation of rodent fibroblasts and activation of BCL － 2［J］.Oncogene，2001，20(10):1176(2011－11－17 收稿)(岳靜玲 編輯)

Construction eukaryotic vector for BARF1 gene of epstein － barr virus

LIU Zhiqun，WANG Meimei，HOU Lingtong，et al(Jitang College of Hebei United University，Tangshan 063000，China)

Objective To construct eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)/BARF1－h(huán)is with recombinant of BARF1 gene encoded by EBV and pcDNA3.1(+)－ his.Methods The specific primers were designed according to the BARF1 gene cDNA sequence in GenBank provided and restriction sites added at both ends;B95 －8 cells was cultured，the cell RNA was extracted，BARF1 gene was amplified by RT－PCR.The PCR products of BARF1 were cloned into pUM －T vector and transformed into E.coli DH5α.The positive clones were screened by ampicillin resistance，identified by restriction enzyme digestion of EcoRI and XbaI.Confirmation the BARF1 gene has been cloned into pUM－T vector.BARF1 fragments were recovered by Gel double－digestion product，and then inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)－ his，transformed into E.coli DH5α.The positive clones were selected by ampicillin resistance，and insertion direction was confirmed by double digestion and sequencing analysis.Results 666bp products of BARF1 were obtained with cDNA by RT－PCR of B95－8 cell RNA.BARF1 gene fragment was inserted into pUM －T vector by identification of double－digestion.BARF1 gene has been properly connected to the pcDNA3.1(+)－h(huán)is eukaryotic expression vector through sequencing analysis.Conclusion The eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)/BARF1 －h(huán)is was constructed successfully.

BARF1.Prokaryotic vector.Recombinant

R 735.2

A

2095－2694(2012)01－004－03

河北省科技廳課題(編號(hào):Z2008316)。

劉智群(1982－)，女，本科，助教，主要研究方向:病毒相關(guān)的腫瘤。

*通訊作者。

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