肖在鵬，史煉鋼，胡 祥，楊佩滿， 邵淑娟，胡 軍，趙瑾瑤

(1.大連市中心醫(yī)院 普外一科, 遼寧 大連 116033; 2. 大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 普外科, 遼寧 大連 116011 ; 3. 大連醫(yī)科大學(xué) 組織學(xué)胚胎學(xué)教研室, 遼寧 大連 116044)

成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織中最常見的細(xì)胞，由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來。電鏡下，成纖維細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體和高爾基復(fù)合體，表明其具有合成和分泌蛋白質(zhì)的功能。己知成纖維細(xì)胞的主要功能之一是合成膠原蛋白及其他細(xì)胞外基質(zhì)，在組織器官纖維化過程中發(fā)揮重要作用。在纖維化疾病的研究中，原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞是基礎(chǔ)工作之一。成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法可分為酶消化法和組織塊法，其中組織塊法因其操作簡(jiǎn)便、條件易于控制而應(yīng)用更為普遍，因此本研究采用組織塊法對(duì)人胃成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，為進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清(TBD Company)；胰蛋白酶(Hyclone，USA)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，USA)；RT-PCR試劑盒(Takara Company)；DNA Marker DL 2000 (Takara Company)；鼠抗人波形蛋白抗體(北京中山試劑公司)；鼠抗人角蛋白抗體(北京中山試劑公司)；TritonX-100(北京中山試劑公司)；FITC羊抗兔IgG (北京中山試劑公司)；羊抗小鼠SP免疫組化試劑盒(北京中山試劑公司)；人Connective Tissue Growth Factor (CTGF)多克隆抗體 (武漢博士德生物技術(shù)公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma,USA)；倒置相差顯微鏡 (Olympus,Japan)；PCR 擴(kuò)增儀(PE2400,USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

采用組織塊貼壁法進(jìn)行人胃成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，其步驟如下：取標(biāo)本前征得患者及家屬同意，并通過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。由手術(shù)臺(tái)上取得胃癌標(biāo)本，立即于臺(tái)下無菌條件下，選擇遠(yuǎn)離腫瘤部分(經(jīng)病理檢查無腫瘤細(xì)胞)，嚴(yán)格切取胃壁的黏膜層，去除皮下脂肪組織，以生理鹽水沖洗去血后，于0.1%洗必泰溶液中浸洗2 min，再以生理鹽水反復(fù)沖洗去除洗必泰，置于盛有含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素DMEM培養(yǎng)液的小玻璃瓶里(冰盒中)，盡快送入實(shí)驗(yàn)室。在超凈臺(tái)上，將瓶內(nèi)胃黏膜組織從瓶中轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中，用生理鹽水沖洗標(biāo)本3次。在培養(yǎng)皿中將胃黏膜組織切成適當(dāng)大小的組織塊(1～2 mm3)，去掉脂肪組織。 另取一無菌培養(yǎng)皿，以眼科鑷將組織塊送入培養(yǎng)皿中擺好，組織塊間距約為5 mm。將無菌蓋玻片輕輕覆蓋在組織塊上，向培養(yǎng)皿內(nèi)緩慢滴加少量含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。 將培養(yǎng)皿置入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度下孵育3 h。 3 h后補(bǔ)加DMEM培養(yǎng)液約3 mL,繼續(xù)于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。3 d后第1次換液，以后每3日換液1次。

1.2.2 成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)、純化、凍存、復(fù)蘇

(1)成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)：當(dāng)從組織塊中游出的細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底約80%時(shí)，進(jìn)行首次傳代，倒去原培養(yǎng)液，用PBS液洗1次棄去，加入0.25%胰蛋白酶1.5 mL消化細(xì)胞，待成纖維細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞變成圓球形、細(xì)胞間隙增大時(shí)傾去胰蛋白酶，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，用吸管從培養(yǎng)皿底一邊開始到另一邊結(jié)束，按順序吹打，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，盡量避免出現(xiàn)泡沫。將脫壁細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)好細(xì)胞密度(0.5×105～1×105cell/mL)，將細(xì)胞懸液按1∶3接種于3個(gè)新的25 mL培養(yǎng)瓶中，并各補(bǔ)加培養(yǎng)液，然后置入37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，這時(shí)所得細(xì)胞多數(shù)為成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)皿中沒有脫壁的主要是上皮細(xì)胞，傳至第3代可獲得足夠數(shù)量的人胃成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

(2)人胃成纖維細(xì)胞的凍存：細(xì)胞消化后，將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管內(nèi)，1000 r/min，離心5 min，棄上清，加入4 ℃預(yù)冷的凍存液(含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、DMSO比例為9∶1)，將細(xì)胞重新混懸，分裝于1 mL凍存管內(nèi)密封。先將凍存管置4 ℃冰箱0.5 h，然后移入-20 ℃冰箱2 h，再將凍存管置于-80 ℃冰箱內(nèi)24 h后放入液氮罐內(nèi)， -196 ℃長期保存。

(3)人胃成纖維細(xì)胞的復(fù)蘇：復(fù)蘇時(shí)將凍存管從液氮罐內(nèi)取出，迅速放入37 ℃水浴中復(fù)溫(1 min)，吸出細(xì)胞懸液注入離心管并加入5 mL DMEM培養(yǎng)液，混勻后1000 r/min 離心5 min，傾去上清液，加入適量含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度為1×106/mL，接種于培養(yǎng)瓶，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第2天更換培養(yǎng)液1次，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 成纖維細(xì)胞的鑒定

(1)相差顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定；(2)用抗波形蛋白、角蛋白的抗體對(duì)傳3 代及以上的細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，完成成纖維細(xì)胞標(biāo)記物鑒定，具體步驟詳見免疫組化試劑盒說明書。

1.2.4 RT-PCR法檢測(cè)人胃成纖維細(xì)胞CTGFmRNA表達(dá)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫，用Primer-3軟件設(shè)計(jì)目的基因PCR擴(kuò)增引物,由大連寶生物公司合成。CTGF:上游引物：5'- AAGTACCAGTGCACGTGCCTG -3';下游引物：5'- TGTAATGGCAGGCACAGGTC -3',擴(kuò)增后片段長度為621 bp。β-actin: 上游引物：5'- TCGTCACCAACTGGGACGACATGG -3'；下游引物：5'- GATCTTGATCTTCATTGTGCTGGG -3'，擴(kuò)增后片段長度為750 bp。參照TRIzol試劑的說明書提取總RNA，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模板用于PCR，反轉(zhuǎn)錄條件為：(1)50 ℃反應(yīng)50 min; (2)95 ℃ 5 min滅活轉(zhuǎn)錄酶;(3) 5 ℃,5 min。應(yīng)用50 μL PCR擴(kuò)增體系，以細(xì)胞cDNA作為模板用于PCR，循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性 5 min, 94 ℃變性 30 s, 55 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 再延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，用美國UVP 凝膠成像系統(tǒng)EC3 System觀察并照相記錄。

1.2.5 免疫細(xì)胞熒光染色法觀察人胃成纖維細(xì)胞中CTGF蛋白表達(dá)

應(yīng)用CTGF多克隆抗體對(duì)傳3 代及以上的細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色，觀察人胃成纖維細(xì)胞中CTGF蛋白表達(dá)情況，具體步驟詳見免疫組化試劑盒說明書。

2 結(jié) 果

2.1 組織塊法原代培養(yǎng)人胃成纖維細(xì)胞

組織塊貼壁后，經(jīng)培養(yǎng)5～7 d，少量的成纖維細(xì)胞開始從組織塊四周游出，隨時(shí)間推移，游出的成纖維細(xì)胞逐漸增多，組織塊周圍可見大量成纖維細(xì)胞包繞，常有成纖維細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞混雜生長，成纖維細(xì)胞生長旺盛，3～4周后，組織塊游出的單層細(xì)胞匯合，細(xì)胞接近鋪滿瓶底，可消化傳代。細(xì)胞純化、傳代、凍存同上(圖1)。

2.2 成纖維細(xì)胞的鑒定

2.2.1 倒置相差顯微鏡下觀察結(jié)果

選第3代生長的人胃成纖維細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈長梭形或星形，體積大小不一，胞體狹長、透亮，胞核呈橢圓形，位于細(xì)胞中央，胞漿豐富，胞膜清晰，至匯合時(shí)，細(xì)胞排列密集，細(xì)胞界限不清，呈放射狀或旋渦狀走行，大小基本一致，排列有一定的方向性(圖2)。

圖1 人胃成纖維細(xì)胞從組織塊周圍游出Fig1 The human gastric fibroblasts grow from the tissue explant

2.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示：波形蛋白染色陽性，胞漿內(nèi)見大量棕黃色顆粒,襯染的核呈藍(lán)色；細(xì)胞角蛋白染色陰性，符合培養(yǎng)條件下成纖維細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記特征(圖3、4)。

圖3 體外培養(yǎng)的人胃成纖維細(xì)胞波型蛋白表達(dá)陽性(免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法)

圖4 體外培養(yǎng)的人胃成纖維細(xì)胞角蛋白表達(dá)陰性(免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法)

2.3 RT-PCR檢測(cè)人胃成纖維細(xì)胞CTGFmRNA表達(dá)情況

從第3代培養(yǎng)細(xì)胞中提出的RNA純度較高，紫外分光計(jì)測(cè)定所提取的RNA OD260/OD280值為1.8～2.0,PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外透射儀下觀察發(fā)現(xiàn)每個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物有一條特異性條帶，與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)相比較，分別為621 bp(CTGF)和750 bp(β-actin)，與預(yù)想結(jié)果一致(圖5)。

圖5 體外培養(yǎng)的人胃成纖維細(xì)胞表達(dá)CTGFmRNA(1、2為CTGF，3、4為β-actin，5為Marker)

2.4 免疫細(xì)胞熒光染色法觀察人胃成纖維細(xì)胞中CTGF蛋白表達(dá)情況

熒光顯微鏡下培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中可見黃綠色熒光，呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，人胃成纖維細(xì)胞表達(dá)CTGF蛋白(圖6)。

圖6 體外培養(yǎng)的人胃成纖維細(xì)胞表達(dá)CTGF蛋白(免疫細(xì)胞熒光染色方法)

3 討 論

原代培養(yǎng)是指細(xì)胞自機(jī)體分離之后至第1次傳代之前的細(xì)胞培養(yǎng)階段，可分為3個(gè)步驟：(1)分離組織；(2)解離組織塊；(3)接種于培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。自組織分離之后，原代細(xì)胞培養(yǎng)可分為兩種：一種是將組織塊用機(jī)械法或酶消化法處理，此方法可以很快得到大量活細(xì)胞，細(xì)胞也可在短時(shí)間內(nèi)生長成片，原代細(xì)胞產(chǎn)量高。酶消化法的缺點(diǎn)是消化酶損傷細(xì)胞，因此消化酶濃度、處理溫度和處理時(shí)間非常重要，同時(shí)消化酶的活力變異很大，細(xì)胞消化程度的判斷很大程度上取決于個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)，掌握起來很困難，無法形成一個(gè)明確的操作規(guī)范。另一種是將組織塊貼附于適宜的基質(zhì)上，細(xì)胞自組織塊向外遷移生長。此方法雖然獲取細(xì)胞所需周期長，不是每個(gè)組織塊都能長出細(xì)胞，不能在短時(shí)間內(nèi)獲取大量細(xì)胞，但其在很大程度上保持了原有組織結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境。組織塊法簡(jiǎn)單、實(shí)用，只要實(shí)驗(yàn)方法正確，持之以恒，必定成功。

本實(shí)驗(yàn)選擇組織塊法分離培養(yǎng)人胃成纖維細(xì)胞，較經(jīng)典組織塊法改進(jìn)了1處：切取標(biāo)本后先以生理鹽水沖洗去血，再以0.1%洗必泰浸洗消毒殺菌。本實(shí)驗(yàn)開始時(shí)細(xì)胞污染率居高不下，反復(fù)思索后方明白其中緣由，正常人胃黏膜表面存在多種細(xì)菌，如不處理，離體培養(yǎng)人胃成纖維細(xì)胞污染率必定很高，所以實(shí)驗(yàn)過程中加0.1%洗必泰浸洗，再以生理鹽水沖洗去洗必泰，大大降低了細(xì)胞污染率。無菌操作是原代細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵，一切操作應(yīng)同手術(shù)操作一樣，嚴(yán)格要求無菌處理。

在原代細(xì)胞早期培養(yǎng)階段，經(jīng)常見到成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞混雜生長，根據(jù)這兩種細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶耐受性不同，成纖維細(xì)胞對(duì)酶性分離敏感，胰酶消化時(shí)成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮樣細(xì)胞需要消化較長時(shí)間才能夠脫壁，而且接種后成纖維細(xì)胞貼壁展開也較快，而上皮細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)不能貼附或貼附不牢，這樣根據(jù)這一特征采用差別消化及反復(fù)貼壁的辦法，去除上皮細(xì)胞和其它細(xì)胞，可獲取純化的成纖維細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用3～6代處于對(duì)數(shù)生長期的人胃成纖維細(xì)胞。

成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織中最主要的細(xì)胞類型，其基本功能是合成和分泌各型膠原蛋白，從而形成膠原纖維，成纖維細(xì)胞也能分泌彈性蛋白等其它細(xì)胞外基質(zhì)成分。成纖維細(xì)胞中間絲的結(jié)構(gòu)蛋白為波形蛋白，不同于上皮細(xì)胞的角蛋白，成為不同種類細(xì)胞分類鑒定的相對(duì)特異性標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)波形蛋白，不表達(dá)角蛋白，這說明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞為人胃成纖維細(xì)胞。

本研究在體外成功地進(jìn)行了人胃成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和傳代，并從形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)等方面對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，為后續(xù)的研究提供了穩(wěn)定的細(xì)胞模型。

在本實(shí)驗(yàn)中，用RT-PCR和免疫熒光染色方法檢測(cè)了體外培養(yǎng)的處于指數(shù)增生期的人胃成纖維細(xì)胞中CTGFmRNA和蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)人胃成纖維細(xì)胞自身能合成、分泌CTGF，是胃癌組織中CTGF的來源之一。自分泌是生長因子的一種重要的分泌方式，自分泌細(xì)胞在產(chǎn)生生長因子的同時(shí)，產(chǎn)生了該生長因子的受體，從而作用于自身細(xì)胞，成纖維細(xì)胞可自分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等[1-2]。其中TGF-β1自分泌廣泛存在于各種成纖維細(xì)胞，與成纖維細(xì)胞增殖、分化以及組織器官纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)在CTGF基因啟動(dòng)子序列-162 bp和-128 bp之間存在著TGFβ應(yīng)答元件TβRE/BCE-1,不存在于CCN家族其它成員或TGFβ誘導(dǎo)的其它基因啟動(dòng)子中，提示TGFβ誘導(dǎo)CTGF表達(dá)具有特異性，其在CTGF基礎(chǔ)表達(dá)的調(diào)節(jié)中起重要作用[6-7]。TGFβ主要通過SMAD3/SMAD4依賴途徑，蛋白激酶C(PKC)和Ras/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)CTGF表達(dá)[8-10]。因此，可推測(cè)人胃成纖維細(xì)胞自身分泌的TGF-β誘導(dǎo)了CTGF的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明活化增生的人胃成纖維細(xì)胞能合成CTGF，通過自分泌、旁分泌途徑作用于自身，為進(jìn)一步研究CTGF與人胃成纖維細(xì)胞的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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