茅衛(wèi)鋒，臧師竹，楊文波

(大連醫(yī)科大學(xué) 生物技術(shù)系，遼寧 大連 116044)

對(duì)陽(yáng)性基因敲除細(xì)胞的篩選是順利完成基因敲除的重要步驟。現(xiàn)在普遍使用PCR方法進(jìn)行快速篩選，一個(gè)引物位于篩選標(biāo)記中，一個(gè)引物位于同源臂外面，根據(jù)有無(wú)PCR產(chǎn)物鑒定陽(yáng)性基因敲除細(xì)胞，這種篩選方法的缺點(diǎn)是沒(méi)有陽(yáng)性對(duì)照，從而導(dǎo)致篩選效率低下。本研究將野生型基因敲除位點(diǎn)內(nèi)的20 bp DNA序列人工合成，加到基因敲除質(zhì)粒嘌呤霉素抗性基因5’端，并設(shè)計(jì)與之配對(duì)的流動(dòng)引物。流動(dòng)引物為PCR下游引物，利用來(lái)自同源臂外DNA序列設(shè)計(jì)PCR上游引物，使用這對(duì)引物PCR擴(kuò)增，野生型和基因敲除陽(yáng)性細(xì)胞克隆都能夠得到PCR產(chǎn)物。正常雙倍體細(xì)胞只有一個(gè)PCR產(chǎn)物，而細(xì)胞一個(gè)等位基因被敲除后，細(xì)胞含有一個(gè)野生型等位基因和一個(gè)敲除的基因座位，利用流動(dòng)引物，可以得到兩個(gè)PCR產(chǎn)物，一個(gè)為野生型較大PCR產(chǎn)物，一個(gè)是敲除后較小的PCR產(chǎn)物。流動(dòng)引物PCR篩選克服普通篩選過(guò)程中沒(méi)有陽(yáng)性對(duì)照的缺點(diǎn)，可以提高篩選陽(yáng)性基因敲除細(xì)胞的效率。利用流動(dòng)引物，作者成功在小鼠體細(xì)胞CH12中篩選到XRCC1一個(gè)等位基因敲除的陽(yáng)性克隆子。報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 構(gòu)建含有流動(dòng)引物的XRCC1基因敲除質(zhì)粒

引物WM11 5’ GTACC CTTTGACCCTCACTGCCAAT 3’和WM12 5’ AATTC ATTGGCAGTGAGGGTCAAAG 3’退火形成雙鏈DNA linker。KpnI和EcoRI酶切XRCC1基因敲除質(zhì)粒pWM3，將linker在DNA T4 連接酶 (Promega，USA)作用下連接到雙酶切的pWM3中，得到含有l(wèi)inker的基因敲除質(zhì)粒pWM4 (圖 1)。WM11為流動(dòng)引物，設(shè)計(jì)篩選陽(yáng)性基因敲除克隆子的上游PCR引物WM5 5’ GTCCTCAGGAGGGAAGGCTA 3’。

圖1 流動(dòng)引物PCR篩選示意圖Fig 1 Diagram of floating primer PCR screening

1.2 XRCC1基因敲除質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到小鼠體細(xì)胞CH12中

使用Amaxa哺乳動(dòng)物電轉(zhuǎn)化系統(tǒng) (Amaxa，USA)將基因敲除質(zhì)粒pWM4轉(zhuǎn)入小鼠體細(xì)胞系CH12中。嘌呤霉素(Puromycin)篩選嘌呤霉素抗性細(xì)胞克隆。提取細(xì)胞總DNA。

1.3 使用流動(dòng)引物篩選陽(yáng)性基因敲除克隆子

使用流動(dòng)引物WM11和上游引物WM5，PCR篩選陽(yáng)性克隆子 (圖1)。PCR程序 94 ℃ 3 min；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸3.5 min；72 ℃ 5 min。

2 結(jié) 果

2.1 陽(yáng)性基因敲除細(xì)胞的篩選

使用流動(dòng)引物和PCR上游引物，正?；蛐图?xì)胞顯示一個(gè)3.0 kb PCR產(chǎn)物(圖2)，1個(gè)等位基因被敲除細(xì)胞顯示兩個(gè)PCR產(chǎn)物，3.0 kb的PCR產(chǎn)物是XRCC1正?；蛐?，2.5 kb 的PCR產(chǎn)物是XRCC1外顯子被敲除后的基因型(圖2)。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig 2 The electrophoregram of PCR products

正常野生型XRCC1基因只有一個(gè)PCR產(chǎn)物。紅色星號(hào)為陽(yáng)性基因敲除克?。? kb PCR產(chǎn)物為野生型基因型，2.5 kb PCR產(chǎn)物為基因敲除基因型。

Normal wild type XRCC1 gene generates one PCR product. The red asterisks are the positive gene knock out clones：3 kb PCR products show the wild type genotype. 2.5 kb PCR product show the gene knock out genotype.

2.2 PCR篩選基因敲除細(xì)胞的效率

本研究挑取100個(gè)嘌呤霉素抗性單克隆細(xì)胞分析基因敲除效率，PCR篩選結(jié)果顯示有3個(gè)單克隆細(xì)胞為單個(gè)等位基因敲除的陽(yáng)性細(xì)胞克隆 (表 1)，顯示敲除單個(gè)等位基因陽(yáng)性率為3%。

表1 使用流動(dòng)引物篩選XRCC1基因敲除細(xì)胞效率Tab 1 The efficiency of utilizing floating primer to screen XRCC1 gene knock out cells

3 討 論

基因敲除技術(shù)做為一種強(qiáng)有力的研究基因功能的工具，已經(jīng)應(yīng)用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)幾乎所有的研究領(lǐng)域[1-3]。 通過(guò)基因敲除技術(shù)研制的人類疾病小鼠模型已經(jīng)超過(guò)500種[4-6]。本研究嘗試在小鼠體細(xì)胞CH12中敲除XRCC1的一個(gè)等位基因，并探索使用流動(dòng)引物高效篩選陽(yáng)性克隆。多種因素影響體細(xì)胞基因敲除的效率，首先基因敲除細(xì)胞系的選擇非常重要，通常選擇具有穩(wěn)定染色體組的二倍體細(xì)胞進(jìn)行敲除，設(shè)計(jì)打靶載體分別敲除位于兩個(gè)染色體上的一對(duì)等位基因。在選擇要進(jìn)行基因敲除的細(xì)胞系時(shí)，要盡量選擇遺傳背景清楚，最好已經(jīng)有成功例子的細(xì)胞系。對(duì)陽(yáng)性基因敲除細(xì)胞的篩選，現(xiàn)在通常都會(huì)先使用PCR方法做第1輪的篩選， PCR結(jié)果呈陽(yáng)性的細(xì)胞用Southern Blot確認(rèn)。

本實(shí)驗(yàn)報(bào)道利用流動(dòng)引物的方法增加PCR篩選的效率。常規(guī)PCR篩選時(shí)，設(shè)計(jì)一個(gè)引物位于篩選標(biāo)記中，一個(gè)引物位于同源臂外面，根據(jù)有無(wú)PCR產(chǎn)物鑒定陽(yáng)性基因敲除細(xì)胞?；虼虬械耐炊瘫?2 kb，PCR橫跨過(guò)同源臂，所以PCR產(chǎn)物一般都接近3 kb, 這種長(zhǎng)度PCR失敗的可能性比較高，而篩選沒(méi)有任何陽(yáng)性對(duì)照，只是根據(jù)有沒(méi)有PCR結(jié)果判斷基因敲除是否成功，導(dǎo)致篩選的效率低下，經(jīng)常會(huì)因?yàn)镻CR本身的原因漏檢了陽(yáng)性基因敲除細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)將野生型基因敲除位點(diǎn)內(nèi)的20 bp DNA序列人工合成，加到基因敲除質(zhì)粒嘌呤霉素抗性基因5’端，并設(shè)計(jì)與之配對(duì)的流動(dòng)引物。使用流動(dòng)引物PCR擴(kuò)增，野生型和基因敲除陽(yáng)性細(xì)胞克隆都能夠得到PCR產(chǎn)物。正常雙倍體細(xì)胞只有一個(gè)PCR產(chǎn)物，而細(xì)胞一個(gè)等位基因被敲除后，利用流動(dòng)引物，可以得到兩個(gè)PCR產(chǎn)物，一個(gè)為野生型較大PCR產(chǎn)物，一個(gè)是敲除后較小的PCR產(chǎn)物。 使用流動(dòng)引物PCR篩選可以克服普通篩選過(guò)程中沒(méi)有陽(yáng)性對(duì)照的缺點(diǎn)，作者使用流動(dòng)引物PCR篩選XRCC1基因敲除細(xì)胞克隆，篩選陽(yáng)性克隆效率為3%。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示流動(dòng)引物可以顯著增加陽(yáng)性基因敲除細(xì)胞的篩選效率。

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