李 暉，關(guān)宏偉

(1.鄭州大學(xué) 西亞斯國(guó)際學(xué)院 護(hù)理學(xué)院，河南 新鄭 451150；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 病理科，遼寧 大連116011)

S100蛋白家族是一類非泛素化、EF-手型鈣結(jié)合蛋白，通過(guò)與鈣離子及靶蛋白的相互作用，在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)作用，參與細(xì)胞周期活動(dòng)、細(xì)胞分化、腫瘤生長(zhǎng)以及細(xì)胞外基質(zhì)分泌活動(dòng)等過(guò)程，其分布具有細(xì)胞、組織特異性。其多個(gè)成員在腫瘤中表達(dá)異常，并與腫瘤的增殖、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和凋亡密切相關(guān)[1]，其中包括S100A6。S100A6又稱為鈣周期蛋白(Calcyclin，Cacy)，過(guò)去也稱為2A9、5BlO、PRA和CACY。

1 S100A6蛋白概述

1.1 S100A6的發(fā)現(xiàn)及基因的染色體定位

S100A6蛋白最初由Kuznicki和Filipek在Ehrlich腹水瘤中檢出，它在細(xì)胞內(nèi)廣泛分布，主要存在于胞質(zhì)、胞膜以及核被膜上，包括核膜的內(nèi)表面；其分布受細(xì)胞分裂狀態(tài)和鈣離子濃度的影響，當(dāng)改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度時(shí)，S100A6的分布也會(huì)發(fā)生改變，與細(xì)胞進(jìn)入S期有關(guān)[2]。

S100A6基因位于人染色體的lq21的250～350 kb之間，并與S100A1～5、S100A7～10，S100C等S100基因家族成員和表皮分化基因共同位于1750 kb區(qū)域之間[3]。S100A6基因與原癌基因ski毗鄰。

1.2 S100A6基因結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)機(jī)制

1.2.1 S100A6的基因結(jié)構(gòu)

S100A6(GenBank accession number，M18981)是單拷貝基因，又稱為催乳素受體相關(guān)蛋白(prolactin receptor-associated protein，PRA)，包含3個(gè)外顯子，被2個(gè)內(nèi)含子所分隔。全長(zhǎng)共470個(gè)核苷酸，起始密碼TGA位于103 bp處，終止密碼位于373 bp處。因此開放閱讀框?yàn)?70個(gè)核苷酸，共編碼90個(gè)氨基酸。

1.2.2 S100A6的基因表達(dá)機(jī)制

為了研究S100A6在細(xì)胞中特異性表達(dá)的分子機(jī)制，首先對(duì)其基因啟動(dòng)子做了相關(guān)研究。研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)E-box元件在S100A6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮作用。其序列分別位于S100A6基因啟動(dòng)子的-283/-278和-593/-588位置。運(yùn)用電泳遷移率變動(dòng)分析法(EMSA,electrophoretic mobility shift assay)和染色質(zhì)免疫沉淀法(chromatin immunoprecipitation)檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)錄因子中的上游刺激因子1(USF1)與兩個(gè)E-box調(diào)節(jié)元件結(jié)合增強(qiáng)了S100A6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性[4-5]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，引起氧化應(yīng)激的因子例如鎘離子使S100A6基因活化，但引起氧化應(yīng)激的因子一旦與位于S100A6基因啟動(dòng)子-290/-281的突變的抗氧化應(yīng)答元件(ARE,antioxidant response element)結(jié)合，由于該元件覆蓋了可被USF識(shí)別的E-box序列，可導(dǎo)致S100A6基因啟動(dòng)子活性被抑制[6]。由此推測(cè)，S100A6的表達(dá)可能對(duì)通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別啟動(dòng)子調(diào)控位點(diǎn)作用的信號(hào)途徑做出了應(yīng)答。

目前，通過(guò)對(duì)外遺傳標(biāo)記物即S100A6基因甲基化和組蛋白變更體檢查顯示，這一由重亞硫酸鹽修飾的DNA序列長(zhǎng)3247 bp，包含了啟動(dòng)子/第一個(gè)外顯子CpG區(qū)域，S100A6基因的編碼序列和一段下游區(qū)域，該段序列顯示它們?cè)赟100A6表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞中呈現(xiàn)非甲基化，例如在淋巴細(xì)胞和人表皮樣癌(Hep-2),而在不表達(dá)S100A6的胚胎性上皮細(xì)胞(HEK293)中則表現(xiàn)為甲基化。運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀法檢測(cè)出在組蛋白H3乙酰化和甲基化的水平上以及體內(nèi)分別表達(dá)S100A6陽(yáng)性和陰性的細(xì)胞中與S100A6基因啟動(dòng)子結(jié)合的USF數(shù)量上都存在差異。由此證明，S100A6的細(xì)胞特異性表達(dá)也是在外遺傳控制的機(jī)制下進(jìn)行的[7]。

1.3 S100A6蛋白功能

S100蛋白成員是多功能信號(hào)蛋白，參與調(diào)控多種細(xì)胞的活動(dòng)。細(xì)胞內(nèi)的S100蛋白可增強(qiáng)物質(zhì)代謝(作用于肌球蛋白重鏈)、促進(jìn)細(xì)胞骨架的解聚作用(作用于微管蛋白)，參與胞吞作用和胞吐作用，調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性，影響轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞產(chǎn)生的S100蛋白分泌到細(xì)胞外可以激活鈣離子通道，增強(qiáng)趨化效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相互作用[8]。S100A6與S100蛋白家族其他成員間存在結(jié)構(gòu)上的同源性，因此，S100A6也參與這些過(guò)程。

S100A6還具有調(diào)控蛋白的磷酸化和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。CacyBP是S100A6的靶蛋白之一，它與S100A6結(jié)合呈Ca2+依賴的形式。最新的研究發(fā)現(xiàn)，一種新的酵母蛋白Sgt1與CacyBP有20%的同源性，其中C末端與CacyBP相似，是S100蛋白結(jié)合部位[9]。在酵母中Sgt1可以與Skp1(SCF泛素連接酶和著絲粒復(fù)合物的成分之一)結(jié)合，Sgt1結(jié)合的SCF復(fù)合物包括β-TrCP蛋白，是β-catenin降解的經(jīng)典泛素連接酶復(fù)合物(SCFβ-TrCP)。S100蛋白能與Sgt1結(jié)合，Sgt1的S100結(jié)合域可以被酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化，而S100A6的結(jié)合能抑制這種磷酸化，所以S100A6對(duì)Sgt1磷酸化的調(diào)控可能是S100-Sgt1相互作用的生理功能[10]。為闡明S100A6在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用，構(gòu)建含有S100A6基因模板鏈或反義鏈的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的Hep3G細(xì)胞后，Ca2+載體處理劑A23187處理細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡條件，發(fā)現(xiàn)S100的過(guò)表達(dá)使Hep3G對(duì)處理劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更加敏感[11]。與此相反，與無(wú)處理對(duì)照組細(xì)胞或轉(zhuǎn)染有S100A6基因模板鏈質(zhì)粒的陽(yáng)性細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染有S100A6反義鏈質(zhì)粒的細(xì)胞細(xì)胞存活力較高，DNA斷裂程度較低，G1期/G0期細(xì)胞數(shù)降低。同一實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)與無(wú)處理組細(xì)胞相比，陽(yáng)性表達(dá)S100A6的Hep3G細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)分子Caspase-3(半胱天冬酶-3)活性增強(qiáng)，而在表達(dá)S100A6陰性細(xì)胞中活性降低。這說(shuō)明S100A6表達(dá)增多通過(guò)增強(qiáng)Caspase-3活性影響誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步運(yùn)用RT-PCR,Western-blot和Caspase-3啟動(dòng)子分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著S100A6含量水平增高，Caspase-3表達(dá)水平也呈一定比例增高，而其他凋亡相關(guān)因子如Caspase-6，Caspase-7，Caspase-8，Caspase-9，Bcl-2，Bax等表達(dá)水平未見差異性變化。以上結(jié)果均暗示，S100A6可能以Caspase-3轉(zhuǎn)錄活化劑的形式參與促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

2 S100A6與腫瘤

2.1 S100A6在腫瘤中異常表達(dá)

在大多數(shù)腫瘤組織中S100A6表達(dá)均有增高[12]，它的異常表達(dá)與細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)，當(dāng)靜止細(xì)胞在生理或病理?xiàng)l件下受到血清、表皮生長(zhǎng)因子、血小板源生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、視黃酸、缺血性損傷等刺激時(shí)，胞內(nèi)S100A6的表達(dá)會(huì)有顯著的升高[13]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在ras轉(zhuǎn)化的NIH3T3細(xì)胞、SV4O轉(zhuǎn)化的鼠成纖維細(xì)胞、人急性粒細(xì)胞白血病、人子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸腫瘤、甲狀腺腫瘤、惡性纖維組織瘤、黑色素細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、口腔黏膜的鱗狀細(xì)胞癌、各種類型的皮膚腫瘤以及上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系等多種增殖旺盛的細(xì)胞中，S100A6均高表達(dá)[14]，高于同種的分化/生長(zhǎng)受抑的細(xì)胞。眾多研究表明，與S100A6相關(guān)的幾種蛋白質(zhì)，包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶、原肌球蛋白、P30、膜聯(lián)蛋白Ⅺ等，與S100A6相互作用形成的復(fù)合物參與細(xì)胞的增殖。

2.2 S100A6與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系

現(xiàn)今S100A6在黑色素瘤和結(jié)直腸腫瘤中表達(dá)異常的研究較多。Maelandsmo等[15]報(bào)道，S100A6的mRNA、蛋白表達(dá)水平在人轉(zhuǎn)移黑色素瘤中一般高于良性痣，但在這兩種組織中S100A4沒有明顯差別，故被認(rèn)為是黑色素瘤細(xì)胞的腫瘤標(biāo)記物。S100A6的高表達(dá)還與黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)，并與患者存活期相關(guān)，低表達(dá)患者存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于高表達(dá)患者。Komatsu等[16]報(bào)道，S100A6在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸腺癌細(xì)胞中的表達(dá)是可逆的，當(dāng)癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中心重新構(gòu)建細(xì)胞與細(xì)胞之間的聯(lián)結(jié)后，其表達(dá)水平下降。S100A6、S100A8、S100A9多聚集于腫瘤的邊緣，故推測(cè)它們可能與腫瘤的侵襲性有關(guān)。Vimalachandran等[17]證實(shí)，胰腺癌患者的腫瘤細(xì)胞核內(nèi)高度表達(dá)S100A6 與其低生存率密切相關(guān)。但Hue等[18]研究S100A6與人骨肉瘤的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，高度表達(dá)的S100A6能限制腫瘤的轉(zhuǎn)移，并抑制腫瘤細(xì)胞的成長(zhǎng)，這一點(diǎn)似乎與以往的研究結(jié)果有所出入。

他們的研究還證實(shí)，高度表達(dá)S100A6的骨肉瘤患者其生存時(shí)間遠(yuǎn)比低表達(dá)S100A6 的生存時(shí)間長(zhǎng)，其中潛在的機(jī)制尚未被闡明。看來(lái)S100A6在腫瘤中的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移性之間的關(guān)系需要進(jìn)一步的研究。

3 S100A6與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

3.1 S100A6調(diào)節(jié)Sgt1與Hsp70和Hsp90的相互作用

Sgt1作為一種在與Skp1蛋白相互作用過(guò)程中能夠活化CBF3著絲粒和SCF泛素連接酶復(fù)合體的蛋白由Kitagawa等人首先在酵母中發(fā)現(xiàn)[19]。Sgt1蛋白由三個(gè)主要結(jié)構(gòu)域組成，即Sgt1的C端部分，N端部分和中心部分。其C端部分也稱為SGS區(qū)域，這一區(qū)域在其所有亞型和同系物Cacy-BP/SIP中的表達(dá)都是統(tǒng)一的。人類Sgt1蛋白的SGS區(qū)主要用來(lái)與S100家族中的一些鈣離子結(jié)合蛋白相互作用[20]。Sgt1蛋白的N端包含了TPR區(qū)，此區(qū)在除Sgt1之外的其它蛋白中與某些分子伴侶蛋白相互作用[21]。事實(shí)上，研究顯示Sgt1的N端部分主要參與與Hsp90的結(jié)合[22-23]。Sgt1的中心部分稱為CS區(qū)，用于與其它一些CS區(qū)包含蛋白相互作用[24]。最近文獻(xiàn)報(bào)道，人類Sgt1蛋白的CS區(qū)在體內(nèi)與分子伴侶蛋白Hsp90相互作用而不是TPR區(qū)[25]。分子伴侶作為一種主要驅(qū)動(dòng)蛋白在許多細(xì)胞性活動(dòng)中如蛋白質(zhì)折疊與成熟，蛋白水解，DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用。Hsp70型分子伴侶參與對(duì)天然蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定過(guò)程以及部分已折疊蛋白質(zhì)在順應(yīng)應(yīng)激條件下的重折疊和解聚過(guò)程[26]。Hsp90的功能雖然較Hsp70來(lái)說(shuō)比較局限，但已證實(shí)它在保護(hù)蛋白抵抗外來(lái)應(yīng)力的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[27-28]。

為研究Sgt1能夠與包含Hsp90在內(nèi)的其它分子伴侶蛋白相互作用，分別運(yùn)用三種不同的檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：免疫共沉淀法，親和層析法和ELISA法。運(yùn)用免疫共沉淀法在轉(zhuǎn)染了編碼Sgt-FLAG質(zhì)粒的HEP-2細(xì)胞用配有抗-FLAG抗體的瓊脂糖免疫沉淀Sgt1-作用蛋白，洗脫蛋白聯(lián)合體，在SDS膠上進(jìn)行分離，分別用抗FLAG標(biāo)簽抗體，抗Hsp70抗體，抗Hsp90抗體對(duì)其進(jìn)行免疫印記分析。結(jié)果顯示，Hsp70和Hsp90都與Sgt1相互作用而被沉淀下來(lái)，同時(shí)，在陰性對(duì)照細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染了只編碼FLAG標(biāo)簽質(zhì)粒的細(xì)胞中，由于非特異性結(jié)合顯示較明顯的背景染色。值得注意的是，在用Hsp90抑制劑-radicicol孵育的細(xì)胞中，未見Hsp90條帶，而Hsp70條帶卻更加明顯。運(yùn)用親和層析法通過(guò)對(duì)HEp-2細(xì)胞提取物中上清液進(jìn)行分離，以不做任何處理和用radicicol進(jìn)行處理作為兩種樣本都運(yùn)用于加有Tris以封閉非特異性結(jié)合的瓊脂糖凝膠樹脂，未聯(lián)合部分運(yùn)用于含有Sgt1的瓊脂糖樹脂。結(jié)果顯示，不管在未處理細(xì)胞還是用radicicol處理過(guò)的細(xì)胞中，Hsp70都能與瓊脂糖凝膠中的Sgt1結(jié)合，而Hsp90蛋白只在未處理細(xì)胞的洗脫液中檢測(cè)到。運(yùn)用ELISA法將重組蛋白Hsp70或Hsp90包被于96孔板中，逐步加入重組蛋白Sgt1，抗Sgt1抗體后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行色度分析。結(jié)果顯示，Hsp70和Hsp90的α和β亞基與Sgt1蛋白相互作用。以上三種不同檢測(cè)方法均證明，Sgt1與分子伴侶蛋白Hsp70存在相互作用。

早期研究發(fā)現(xiàn)，Sgt1的C端即SGS區(qū)，存在263～333個(gè)氨基酸殘基，能夠以一種Ca2+依賴方式與S100A6結(jié)合[21]。為研究S100A6對(duì)Sgt1-Hsp90和Sgt1-Hsp70相互作用的調(diào)節(jié)，分別對(duì)轉(zhuǎn)染有編碼Sgt1-FLAG質(zhì)粒的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染有編碼S100A6質(zhì)粒的細(xì)胞提取蛋白，用配有抗-FLAG標(biāo)簽抗體的瓊脂糖凝膠對(duì)兩種細(xì)胞蛋白做免疫沉淀檢測(cè)。結(jié)果顯示，S100A6的過(guò)表達(dá)或表達(dá)增高降低了與Sgt1蛋白結(jié)合的Hsp90和Hsp70的結(jié)合量。用經(jīng)鈣離子螯合劑BAPTA/AM處理過(guò)的細(xì)胞做同樣實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與Sgt1蛋白結(jié)合的Hsp90或Hsp70的量與轉(zhuǎn)染有只編碼Sgt1-FLAG質(zhì)粒的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染編碼S100A6基因質(zhì)粒的細(xì)胞中結(jié)合Sgt1的Hsp90，Hsp70蛋白量相近。這個(gè)結(jié)果暗示了S100A6通過(guò)Ca2+依賴方式結(jié)合到Sgt1的C端從而調(diào)節(jié)Sgt1與分子伴侶蛋白的相互作用。

3.2 S100A6能夠增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的活性

Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，但其異常激活的機(jī)制尚未闡明。為了解Wnt/β-catenin信號(hào)途徑失調(diào)的原因和機(jī)制，人們開始研究β-catenin及其上游基因的調(diào)控機(jī)制[29-31]。

將含有人S100A6基因的pHAHA—hS1006質(zhì)粒中的hS100A6亞克隆到pGST-Moluc和pAdTrack-CMV中，構(gòu)建pGST-Moluc-hS100A6 和 pAdTrack-CMV-hS1006，用pGST-Moluc-hS100A6轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21，誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化該融合蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。 用空載體pGST-Moluc同時(shí)制備GST融合蛋白作為對(duì)照。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后重組菌的總蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，分別在36 000和26 000處有一條明顯增粗的條帶且與GST一S100A6融合蛋白和GST的分子量相符，谷胱甘肽-瓊脂糖4B球珠混懸液親和層析分離純化，測(cè)定蛋白純度為92%。

接種人骨肉瘤細(xì)胞株MG63和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞于12孔板，待細(xì)胞融合達(dá)50%～60%時(shí)，加入表達(dá)有hS100A6的重組腺病AdS100A6(以AdGFP為對(duì)照)，熒光顯微鏡下觀察腺病毒感染率，并分別于48、72 h收集細(xì)胞。SDS-上樣緩沖液裂解細(xì)胞，離心收集裂解液上清，紫外分光法進(jìn)行蛋白定量后行SDS-PAGE和Western blot分析。分別加入一抗兔抗人β-catenin多克隆抗體(1：500)和β-actin(1：200)，二抗羊抗兔IgG(1：5000)。ECL試劑盒檢測(cè)結(jié)果，Gel Doc凝膠成像儀采集圖像，定量分析軟件測(cè)定各條帶灰度值。Western blot結(jié)果顯示，在AdS100A6感染48、72 h后，MG63和HCT116細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)均較對(duì)照組明顯增加；同時(shí)，以β-catenin為內(nèi)參對(duì)照，進(jìn)一步驗(yàn)證AdS100A6作用HCT116細(xì)胞48 h后β-catenin變化，該組灰度值是對(duì)照組的2.1倍。提示S100A6能增加MG63和HCT116細(xì)胞β-catenin的水平。

將人胚胎腎細(xì)胞株HEK293細(xì)胞接種于12孔板，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，用脂質(zhì)體PolyFect將報(bào)告子基因質(zhì)粒pTOP—Luc轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，16 h后分別加入終濃度為40 μg/mL的GST-S100A6和GST，36 h后收集細(xì)胞裂解液上清進(jìn)行蛋白定量。取總蛋白為20 μg的細(xì)胞裂解液上清與100 μL熒光素酶檢測(cè)試劑反應(yīng)，以pFop-luc為陰性對(duì)照，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性，并以此來(lái)反映細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物β-catenin/T細(xì)胞因子4(TCF4)的轉(zhuǎn)錄活性[30]。結(jié)果顯示，GST-S100A6能夠增加轉(zhuǎn)染Ptop-Luc的HEK293細(xì)胞的熒光素酶活性20.2倍，但對(duì)轉(zhuǎn)染Pfop-Luc的HEK293細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)影響，且GST對(duì)照組與空白對(duì)照HEK293細(xì)胞的熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示S100A6能夠特異性上調(diào)β-catenin/TCF4的轉(zhuǎn)錄活性。

電穿孔法分別將質(zhì)粒pcDNA-GSK-3β-HA、pCMV-Dvl-Myc和pCMV-Axin-Myc轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)36 h后收獲富含GSK-3β-HA、Dv-Myc和Axin-Myc的細(xì)胞裂解液上清；直接裂解HEK293細(xì)胞獲得含β-catenin的細(xì)胞裂解液上清。細(xì)胞裂解液上清均用谷胱甘肽-瓊脂糖4B球珠進(jìn)行預(yù)清潔，以清除與球珠非特異吸附的蛋白。預(yù)清潔后的細(xì)胞裂解液上清各100 μL與10 μg GST—hS100A6在冰浴中孵育1 h后加入15 μL谷胱甘肽-瓊脂糖4B球珠，在冰浴中翻轉(zhuǎn)搖動(dòng)孵育3 h，4℃離心收獲球珠，洗滌3次后加入等體積1倍的SDS-上樣緩沖液，煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。以GST為陰性對(duì)照，以富含GSK-3B-HA、Dv1-Myc、β-catenin和Axin-Myc的細(xì)胞裂解液上清為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，各陽(yáng)性對(duì)照組，GST-S100A6-β-catenin組，GST-S100A6-GSK-3β-HA組和GST-S100A6-Dvl-Myc組均有特異性雜交條帶出現(xiàn)；而GST-S100A6-Axin-Myc組和各GST對(duì)照組則未出現(xiàn)特異性條帶。提示S100A6與β-catenin，GSK-3β和Dvl在體外可能存在著某種直接的相互作用，而與Axin之間并無(wú)直接相互作用。由此推測(cè)，S100A6與β-catenin的直接相互作用可能會(huì)直接抑制β-catenin的降解，導(dǎo)致其在胞漿內(nèi)的水平增加，從而使Wnt/β-catenin信號(hào)途徑活性[32-33]的活性增強(qiáng)；在人類腫瘤中，尚未檢測(cè)到GSK-3β的基因突變，但其活性可下調(diào)。對(duì)于S100A6與其的直接相互作用可能是通過(guò)實(shí)現(xiàn)對(duì)其活性的調(diào)節(jié)，從而抑制β- catenin的磷酸化，使β-catenin降解受阻而致胞漿內(nèi)水平增加。Dvl蛋白是該信號(hào)的正性調(diào)節(jié)因子，具有DIX，DEP和PDZ三個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中PDZ域能與EF手型基序以鈣非依賴方式結(jié)合[34-35]，這可能是Dvl與S100A6之間直接相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。這種相互作用可能通過(guò)促進(jìn)Dvl的功能，從而抑制β-catenin的磷酸化依賴性降解，導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的活性增強(qiáng)。

β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)途徑中的關(guān)鍵分子，其在胞漿內(nèi)的表達(dá)水平?jīng)Q定著β-catenin/TCF-4的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，從而影響著該信號(hào)途徑的活性。結(jié)腸腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli,APC)，GSK-3β，Axin和Dvl可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)β-catenin的磷酸化依賴性降解水平，其中前三者是促進(jìn)降解，后者是抑制降解。由于這些分子的異常表達(dá)所導(dǎo)致的β- catenin磷酸化依賴性降解受阻，使胞漿內(nèi)β-catenin累積并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與TCF4結(jié)合，從而使β-catenin/TCF4的活性增高，信號(hào)途徑活性增強(qiáng)[34-35]。S100A6能增加β-catenin的表達(dá)水平并上調(diào)β-catenin/TCF4活性，提示S100A6具有增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑活性的作用，這可能正是S100A6參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。

4 展 望

S100A6作為一種鈣結(jié)合蛋白，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，盡管對(duì)其性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)等方面有了一定的了解，但不夠全面，在以后的研究中有待進(jìn)一步拓展，特別是在細(xì)胞增殖、凋亡，腫瘤發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中的生物學(xué)作用機(jī)制；與S100蛋白家族中其他成員的關(guān)聯(lián)和相互協(xié)同作用；利用反義核酸技術(shù)阻斷S100A6的表達(dá)是否可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)；靶蛋白分子的鑒定等方面。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)方法、生物信息學(xué)工具以及基因芯片、RNA干擾、小RNA等分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用及改進(jìn)，S100A6基因的表達(dá)和生物學(xué)功能會(huì)逐步明朗化，有望應(yīng)用于腫瘤及其轉(zhuǎn)移的早期檢測(cè)、診斷和治療。

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