凌孫彬，唐 博，王立明

(1.大連醫(yī)科大學 七年制2007級，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 普外三科，遼寧 大連 116027)

近年來，蛋白質組學的發(fā)展為腫瘤研究提供了全新的方法和思路，細胞水平的腫瘤蛋白質組學研究得到了廣泛的開展，但是，現有分離技術下往往難以一步到位地獲得細胞的全蛋白質組，大量的低豐度蛋白質未能得到顯現和分析。因此，亞細胞蛋白質組學的開展可以作為傳統(tǒng)蛋白質組學的重要補充，同時也極大地降低了針對全細胞蛋白質組學研究的復雜性。線粒體(mitochondria，Mt)是真核細胞中一種重要的細胞器，除作為能量產生的場所外，已發(fā)現其參與包括腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展在內的多種病理生理過程[1]。線粒體蛋白質組學已被運用于部分腫瘤的研究中，進一步闡明線粒體蛋白質與腫瘤的關系，有助于尋找新的腫瘤相關特異性蛋白。本文就線粒體蛋白質組學在腫瘤研究中的進展進行綜述。

1 線粒體蛋白質組學概述

線粒體蛋白質組學的研究主要集中在兩方面：(1)線粒體蛋白質表達譜的建立；(2)運用比較蛋白質組學的方法尋找疾病組和對照組的差異表達蛋白，研究蛋白質表達量的變化、翻譯后修飾以及細胞內定位改變等。線粒體蛋白質組研究常用技術包括：(1)用于蛋白質分離純化的雙向凝膠電泳(2DE)、二維液相色譜(2D-LC)以及常用于亞細胞分離的差速離心和密度梯度離心技術；(2)蛋白質鑒定技術:質譜技術(MS)、凝膠圖像分析、蛋白質測序及氨基酸組成分析等；(3)用于蛋白質相互作用及作用方式研究的酵母雙雜交系統(tǒng)、親和層析和蛋白質芯片技術等；(4)生物信息學。

目前，對復雜蛋白質的分析一般有兩條技術路線：經典的雙向凝膠電泳-質譜技術(2-DE-MS)和二維液相色譜-串聯(lián)質譜(2D LC-MS/MS)。2-DE-MS可以反映蛋白質分子的分子質量、等電點、疏水性以及結合特性，而對低豐度、極端分子量、堿性、疏水性蛋白的分辨率低。線粒體是一個具有雙層膜結構的細胞器，內膜和外膜上整合有很多膜蛋白質，這些膜蛋白質對于線粒體功能的發(fā)揮具有重要作用，但是膜蛋白質具有很強的疏水性， 2DE-MS對線粒體蛋白的分離有局限性。2D LC-MS/MS可以彌補經典策略的不足，不受蛋白質等電點、分子量、疏水性的限制，且自動化程度高。Pflieger等[2]應用LC-MS/MS成功的鑒定出179種線粒體蛋白質，其中43%是膜蛋白質而且23%具有跨膜結構域。2D LC-MS/MS主要的不足在于提供的關于完整蛋白質的分子信息非常有限，尤其是有關翻譯后修飾的信息量較少。目前對線粒體分離純化的技術主要為差速離心結合密度梯度離心，該技術可以減少樣品污染，同時較好地保護線粒體不受破壞[3-4]。此外，本實驗室采用以磁性納米粒子為介質的線粒體分離技術，得到了更高的分離率和純度。

2 線粒體與腫瘤的關系

線粒體(mitochondria，Mt)是細胞中進行生物氧化和能量轉換的細胞器，含有1000～2000種蛋白質, 約占整個細胞蛋白質種類的5%～10%，在這些蛋白質中，有2%是線粒體自己合成的，98%是由細胞核編碼、細胞質核糖體合成后運往線粒體的，因此，線粒體是一種半自主性的細胞器。線粒體不僅維持細胞的正常生理功能，還在信號轉導、細胞凋亡、自由基生成、細胞內離子的跨膜轉運及電解質穩(wěn)態(tài)平衡的調控中發(fā)揮重要的作用。線粒體有自己的遺傳系統(tǒng)和蛋白質翻譯系統(tǒng)，人線粒體DNA(mtDNA)是一個16 569 bp的雙鏈環(huán)狀閉合分子，編碼13種蛋白質，22種tRNA和2種rRNA。D環(huán)(D-loop)是mtDNA主要的非編碼區(qū)，包含了線粒體基因復制和轉錄的調控序列，其中央保守區(qū)呈現高度保守性[5]。mtDNA突變和線粒體本身功能的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和細胞凋亡密切相關[6]。mtDNA易受損傷，突變率遠高于nDNA。mtDNA突變常發(fā)生于D-loop區(qū)，D-loop區(qū)控制著mtDNA的復制和轉錄，可引起mtDNA拷貝數的改變和某些基因的異常表達[7]。早在1956年，Warburg[8]提出線粒體呼吸鏈的缺陷可以導致細胞去分化，并因此促進細胞癌變，而最近認為mtDNA的突變可以引起線粒體呼吸鏈的異常，進而導致腫瘤發(fā)生[9-10]。線粒體還參與細胞凋亡過程，其功能的異常能使腫瘤細胞獲得較強的抗凋亡能力[11-12]，一些特異性定位于線粒體的腫瘤相關因子，也被發(fā)現參與對腫瘤細胞生長及凋亡的控制[13-14]。

3 線粒體蛋白質組學在腫瘤研究中的進展

3.1 線粒體蛋白質組學用于腫瘤差異蛋白的篩選

目前，仍有大量的線粒體蛋白未被鑒定，基于線粒體與腫瘤的相關性，線粒體蛋白質組學在腫瘤研究中顯示出重要意義。Hermann等[15]采用蛋白質組學技術定量分析了線粒體和核分別編碼的細胞色素C氧化酶(COX)亞單位間的比率，發(fā)現該比率與前列腺組織惡性進程相關。該研究說明了核編碼線粒體蛋白質在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了重要作用，同時也顯示出對完整線粒體蛋白質組鑒定的重要意義。Kim等[16]采用蛋白質組學技術分析了人胃癌細胞系AGS，發(fā)現了4種高表達線粒體蛋白質：泛醇-細胞色素C還原酶(ubiquinol-cytochrome C reductase)、烯酰輔酶A水合酶-1短鏈(mitochondrial short-chain enoyl-coenzyme A hydratase-1)、HSP6、線粒體延伸因子T(mitochondria elongation factor T)，這些蛋白可能成為存在于腫瘤細胞線粒體上的生物標記物。中國Li等[17]在對肝癌亞細胞結構的蛋白質組比較分析中，發(fā)現了14個差異表達的線粒體蛋白質，包括參與細胞能量代謝的相關酶類、細胞骨架蛋白及蛋白質代謝相關蛋白，說明線粒體參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個過程。最近，Chen等[18]在對3種惡性程度和侵襲潛能不同的乳腺癌細胞系的線粒體差異蛋白質組學分析中，發(fā)現了新的具有診斷意義的相關蛋白。

3.2 線粒體蛋白質組學用于腫瘤耐藥相關蛋白的篩選

腫瘤細胞的耐藥性與細胞內凋亡機制的異常改變密切相關，而線粒體對腫瘤細胞凋亡的調控可直接影響其耐藥性。Jiang等[19]比較了非霍奇金淋巴瘤(NHL)拉吉細胞(Raji cells)阿霉素(ADR)培養(yǎng)與正常培養(yǎng)細胞株之間線粒體蛋白的表達差異，發(fā)現了ADR培養(yǎng)的細胞線粒體中熱休克蛋白70(HSP70)、抗增殖蛋白(prohibitin，PHB)和人腺苷三磷酸結合盒轉運體B6(ATP-binding cassette transporter isoform B6，ABCB6)的異常表達。HSP70可抑制細胞內氧化應激和細胞凋亡，其高表達常提示腫瘤患者預后不良[20]； ABCB6定位于線粒體外膜，與細胞內的物質運輸有關，它的異常表達可能影響細胞內穩(wěn)態(tài)，從而起到促腫瘤和腫瘤細胞多藥耐藥等作用，但具體機制仍不清楚[21]；PHB可能通過與Rb蛋白(retinoblastoma protein)作用，抑制轉錄因子E2F的活性，抑制腫瘤細胞凋亡[22]。但是，最近Dai等[23]采用差示凝膠電泳(DIGE)技術分離樣品，比較了鉑類化療藥敏感的卵巢癌細胞系SKOV3、A2780和鉑類化療藥不敏感的卵巢癌亞細胞系SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP、A2780/CBP之間線粒體蛋白質表達譜的差異，發(fā)現在耐藥細胞系線粒體中有PHB表達的顯著下調，認為卵巢癌細胞的耐藥性與線粒體中PHB的低表達有關。PHB被認為定位于細胞核、線粒體內膜等處，上述現象可能與PHB在不同細胞內的定位差別以及不同的線粒體分離技術有關；同時，PHB的功能也存在爭議，以上研究至少可以說明亞細胞分離技術在研究細胞內廣泛定位的蛋白時的重要作用。另外，Jiang等[24]還分析了耐放療NHL拉吉細胞株的線粒體蛋白質組，鑒定出了23種差異表達蛋白，其中GAPDH、RECQL4、MKI67和ATAD3B可能作為腫瘤細胞耐受放療的潛在標記物。

4 展 望

由于有兩套相對獨立的蛋白質編碼系統(tǒng)的存在以及線粒體與細胞凋亡、信號轉導等功能的密切相關性，線粒體基因和蛋白水平上的變化極易引起細胞功能的紊亂。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，細胞線粒體本身數量與功能的改變也會引起相關蛋白含量的變化。目前，線粒體蛋白質組學的研究和應用仍不廣泛，但是，既往的研究已經體現出線粒體蛋白質組學技術在腫瘤研究中的價值，隨著蛋白質組學技術的不斷發(fā)展，尤其是亞細胞分離技術的進步，線粒體蛋白質組學將成為腫瘤研究中新的熱點。

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