王媛媛，曹春紅，楊旭，肖冬光

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津，300457)

核苷酸類物質(zhì)及其衍生物是遺傳工程、醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科研領(lǐng)域十分重要的生化試劑和原料［1］，核苷酸幾乎在所有的細胞結(jié)構(gòu)、代謝、能量和調(diào)節(jié)功能等方面起著重要作用［2］。Uauy表明［3］將核苷酸添加到以牛奶為基礎(chǔ)的代乳品中，對嬰幼兒的胃腸道發(fā)育、胃腸道健康的維持以及血漿脂蛋白的組成都有有利的影響，Brunser［4］研究結(jié)果表明外源核苷酸能減少嬰兒腹瀉的發(fā)生。從全球來看，核苷酸供不應(yīng)求，是很有發(fā)展?jié)摿Φ捻椖俊?/p>

核酸酵母是工業(yè)上制取核酸的常用材料［5－6］，目前核酸酵母的培養(yǎng)多數(shù)采用以糖蜜為碳源的培養(yǎng)基，糖蜜內(nèi)除了含有大量可發(fā)酵糖(主要是蔗糖)外，還含有豐富的礦物質(zhì)與維生素，是培養(yǎng)酵母較好的碳源。工業(yè)生產(chǎn)中核酸酵母菌體培養(yǎng)濃度偏低，大多在10g/L左右，主要原因是核酸酵母只有在對數(shù)期收獲才可得到較高核酸含量，延長培養(yǎng)時間提高細胞濃度，往往不能保證在對數(shù)生長期收獲菌體，致使菌體細胞內(nèi)的核酸含量下降。本研究通過對糖蜜原料處理工藝及對核酸酵母的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，旨在延長酵母生長的對數(shù)期，在保證高核酸含量的同時，提高酵母細胞濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

高核酸酵母NY-1(High nuclear Saccharomyces NY-1)天津科技大學(xué)微生物菌種中心保藏。

1.1.2 實驗材料

工業(yè)糖蜜;尿素，NaCl、ZnSO4、FeSO4、MgSO4、KH2PO4，等均為化學(xué)純試劑;瓊脂、酵母浸粉為生化試劑。

1.1.3 實驗儀器

UV757型紫外光柵分光光度計、752N可見分光光度計，上海精科上海分析儀器廠;GHP-9050生化培養(yǎng)箱，上海精密儀器廠;HH-2數(shù)顯溫控水浴鍋，蘇州學(xué)森儀器設(shè)備有限公司;TDZ5-WS高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.1.4 液體發(fā)酵培養(yǎng)基

總糖 40 g/L，MgSO41.2 g/L，尿素 1.2 g/L，(NH4)2SO40.3 g/L，ZnSO40.15 g/L，無水 FeSO40.15 g/L，NaCl0.1 g/L，H3PO41.8 mL，用氨水調(diào)節(jié)至pH 5.0。

1.2 方法

1.2.1 酵母泥RNA含量測定［7］

吸取4 mL發(fā)酵液于4 000r/min、10 min離心，棄上清液，稱菌體濕重;用生理鹽水洗滌菌體2次，再加入2 mL生理鹽水振蕩均勻，再加入2 mL 10%的高氯酸溶液，搖勻，于70℃水浴鍋保溫20 min(每5 min振搖1次);再于10 000 r/min、5 min條件下離心。將上清液稀釋50倍后于紫外分光光度計260 nm處測光密度OD值，計算干菌內(nèi)含RNA的質(zhì)量分數(shù)(%)。

空氣開關(guān)屬于一種電器元件，其存在優(yōu)勢的同時也存在著一定的缺點，也并不是在任何條件下都能將其自身的優(yōu)勢發(fā)揮出來。筆者在多年的實踐工作中發(fā)現(xiàn)使用空氣開關(guān)保護變壓器時，如果變壓器的輸出端出現(xiàn)短路的現(xiàn)象，空氣開關(guān)將不能起到保護的作用。因此為了能夠?qū)⒋祟悊栴}解決，應(yīng)從空氣開關(guān)的自身工作原理與變壓器的工作參數(shù)和結(jié)構(gòu)角度出發(fā)，分析其不能對變壓器起到保護作用的因素。[1]

1.2.2 發(fā)酵液菌體干重的測定

取定量發(fā)酵液離心洗滌2次，將濕菌體于105℃烘干箱內(nèi)烘干至恒重。

1.2.3 殘余還原糖測定方法

取發(fā)酵液樣品，離心，將上清液用斐林滴定法測定。

1.2.4 總糖的測定方法［8］

用4 mol/L的鹽酸將待測樣品在68℃水浴下進行水解，待溫度達到68℃開始計時10 min，間斷搖勻，冷卻后，用NaOH溶液中和至中性并定容至100mL，然后用斐林滴定法測定。

1.2.5 糖蜜原料的處理工藝優(yōu)化

1.2.5.1 糖蜜初始處理條件［9］

1.2.5.2 糖蜜優(yōu)化處理條件

方案1:用濃H2SO4調(diào)節(jié)至pH 3.8，在電爐上煮沸1 h。

方案2:用濃H2SO4調(diào)節(jié)至pH 4.0，在電爐上煮沸1 h。

方案3:用濃H2SO4調(diào)節(jié)至pH 4.0，在電爐上煮沸1.5 h。

冷卻后將3個樣品進行離心，取上清分別進行還原糖及總糖測定。

2 結(jié)果分析

2.1 氮源優(yōu)化

在以糖蜜為碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加5種不同的氮源，(NH4)2SO4、尿素、酵母粉3種單一氮源及(NH4)2SO4與酵母粉、尿素與酵母粉2種復(fù)合氮源分別進行發(fā)酵培養(yǎng)，選出最適合酵母生長的氮源。

2.1.1 氮源種類的選擇

氮源總添加量與1.1.4中氮源的添加量相同，其中，酵母粉以含氮量12%，菌體利用率50%計算。

圖1 氮源種類選擇實驗結(jié)果

由圖1知，添加了酵母粉的實驗組在菌體干重、發(fā)酵液中RNA含量及RNA理論產(chǎn)量上都明顯優(yōu)于其他實驗組，但是由于酵母粉的價格較高，因此應(yīng)選擇酵母粉和尿素的復(fù)合氮源培養(yǎng)該菌，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化酵母粉和尿素的添加比例，以在提高酵母產(chǎn)量的同時盡可能減少酵母粉用量，從而降低生產(chǎn)成本。

2.1.2 復(fù)合氮源比例的選擇

圖2 復(fù)合氮源最適添加量的優(yōu)化選擇

總氮源添加量相同的前提下，將酵母粉與尿素以不同比例混合添加，接種高核酸酵母菌株進行液態(tài)發(fā)酵，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，隨著酵母粉添加量的增加，菌體的干重和RNA含量都有所提高，但提高幅度都不是很明顯，從節(jié)約成本考慮，采用酵母粉添加量為2 g/L，尿素添加量為2.5 g/L。

2.2 培養(yǎng)基初始pH值優(yōu)化

圖3 培養(yǎng)基初始pH值優(yōu)化結(jié)果

由圖3可以看出初始pH 5.0的實驗組，其RNA理論產(chǎn)量最高，菌體干重也相對較高，因此選取培養(yǎng)基的初始pH值為pH5.0。

2.3 投糖濃度對NY-1生長的影響

圖4所示為3種糖濃度下酵母的生長曲線，從圖4可以看出，該菌在3種投糖濃度下生長時均在6h進入減速生長期，且菌體生物量沒有顯著差別，糖濃度為40、50和60g/L時，菌體濃度分別為8.72、8.34和8.66g/L。投糖濃度越高，酵母對糖的利用率就越低，說明培養(yǎng)基中的糖未得到有效利用。

圖4 三種投糖濃度下菌體的生長曲線

糖濃度為60 g/L時發(fā)酵過程中發(fā)酵液總糖和還原糖的變化情況見表1。從表1看，發(fā)酵至6 h時，發(fā)酵液中還原糖的含量降至6.95 g/L，糖濃度較低可能是酵母進入減數(shù)生長期的原因之一。另一方面，發(fā)酵至6 h時的總糖濃度為25.1 g/L，糖蜜中的蔗糖基本上沒有水解，這說明該菌體的蔗糖酶活性偏低，對蔗糖的利用速率較慢。因此要延長菌體生長的對數(shù)期，應(yīng)先從糖蜜的預(yù)處理方法上著手，即提高糖蜜處理完后總糖的水解率。

表1 投糖60 g/L時發(fā)酵過程中發(fā)酵液總糖和還原糖的變化情況

2.4 糖蜜處理工藝優(yōu)化

2.4.1 不同糖蜜處理方法下總糖的水解情況

表2為不同糖蜜處理工藝下總糖的水解情況，由表2知，加熱時間相同，酸度越低，蔗糖水解率越高;酸度相同，加熱時間越長，蔗糖水解率越高。本實驗中總糖水解率最高的糖蜜處理條件為方案3，即用H2SO4調(diào)節(jié)至pH4.0，煮沸1.5 h，此時總糖的水解率可達到75%。

表2 不同糖蜜處理方法下總糖水解情況

2.4.2 提高糖蜜水解率前后菌體培養(yǎng)結(jié)果

圖5為提高糖蜜水解率后菌體的生長曲線，從圖5看，提高糖蜜水解率后，相同投糖濃度(60 g/L)，菌體生長的對數(shù)期被延長大約3 h，菌體濃度提高約25%。表3為提高糖蜜水解率后發(fā)酵過程中總糖與還原糖的情況，從表3看，發(fā)酵至6 h時還原糖含量為12.4 g/L，明顯高于提高水解率前的糖濃度;發(fā)酵至9 h時，發(fā)酵液中還原糖含量下降至6.5 g/L，與未處理糖蜜時發(fā)酵6 h時還原糖濃度相當，酵母進入減速生長期，說明提高糖蜜中總糖的水解率后可以延長酵母對數(shù)生長期，提高糖的利用率。

圖5 提高糖蜜中蔗糖水解率前、后核酸酵母的生長曲線

表3 提高糖蜜總糖水解率后發(fā)酵液總糖和還原糖的變化情況

表4為提高糖蜜總糖水解率前后培養(yǎng)核酸酵母的結(jié)果，由表4可知，提高糖蜜總糖水解率后，菌體RNA含量提高了16.5%，但菌體濃度基本不變，酵母對糖的得率仍然較低。

表4 提高糖蜜總糖水解率前后60 g/L投糖時菌體生長情況對比表

2.5 溶氧對菌體生長的影響

表5為溶氧對菌體生長的影響，由表5可以看出，在普通的三角瓶內(nèi)，減少裝液量可以提高菌體的生物量，用擋板瓶代替普通的三角瓶提高溶氧效果，可明顯提高菌體的生物量，可見提高溶氧有利于菌體生物量的增加。

表5 溶氧對菌體生長的影響

3 結(jié)論

實驗證明，核酸酵母在生長過程中對溶氧的需求較高，其內(nèi)的蔗糖酶活性較低，因此，在工業(yè)生產(chǎn)中要著重完善供氧設(shè)備，同時采用較高的糖蜜水解率。另外，可從菌種出發(fā)，篩選出蔗糖酶活性高的核酸酵母，這樣在工業(yè)生產(chǎn)過程中可大大減少糖蜜原料處理過程中的用酸量，有利于進一步降低生產(chǎn)成本。

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