柯濤，熊藍，張乃群，馬向東，惠豐立，牛秋紅，楊果

1(南陽師范學院生命科學與技術學院，河南南陽，473061)2(湖北大學生命科學學院，湖北武漢，430062)

α-淀粉酶(1，4-α-D-葡萄糖苷葡萄糖苷水解酶，EC 3.2.1.1)為內切型淀粉酶，從淀粉內部水解1，4-α-D-葡萄糖苷鍵。廣泛應用在淀粉糖品生產(chǎn)、發(fā)酵、紡織等行業(yè)。是目前用途最廣的一種酶制劑［1］。

發(fā)酵工業(yè)中對淀粉原料的加工工藝廣泛使用雙酶法，α-淀粉酶需要與糖化酶配合使用，依次對淀粉原料進行液化和糖化處理。液化過程現(xiàn)廣泛采用噴射液化，淀粉大顆粒經(jīng)噴射液化器，在105～110℃的高溫下膠化，而整個過程中pH值控制是另一個關鍵因素。淀粉糊的自然pH值為3.5～4.2，糖化酶的最適pH也在酸性范圍(4.5～4.0)，因此，超耐熱酸性α-淀粉酶替代常用的芽孢桿菌中性淀粉酶應用到液化過程，可以避免pH的反復調節(jié)，同時可以降低能耗、提高轉化率、簡化工藝、減少環(huán)境污染，使產(chǎn)品產(chǎn)量和質量大大提高［2－4］。

對耐熱淀粉酶的研究目前以嗜熱古菌淀粉酶基因為研究熱點，因為它們能在酸性環(huán)境、80～110℃的環(huán)境下生長良好，產(chǎn)生的耐熱酶在高溫和酸性條件下具有很好的穩(wěn)定性，而細菌來源的淀粉酶無法滿足pH的要求［5－6］。目前已發(fā)現(xiàn)來源于嗜熱古菌的 α-淀粉酶基因已有30多個［7－8］，但并不是所有基因都能符合現(xiàn)行工藝要求。其中最適溫度在95℃以上，pH5.0以下且基因已經(jīng)被克隆的酸性α-淀粉酶只有來自Pyrococcus furiosus的高溫酸性淀粉酶基因得到深入的研究［9］，國內對高溫酸性淀粉酶的研究也大多集中在這個基因的表達上［10－11］。但現(xiàn)有基因還不能完全滿足生產(chǎn)的要求，因此，進一步開發(fā)嗜熱古菌淀粉酶基因資源是首要解決的問題。

Richardson等從環(huán)境微生物DNA文庫中克隆到一系列可能來源于一種嗜熱球菌屬(Thermococcus)的高溫酸性α-淀粉酶基因，并通過定向進化技術篩選到幾個高溫酸性α-淀粉酶的人工突變體，在熒光假單胞 菌 Pseudomonas fluorescens中 表達［3］。其 中BD5088基因最適pH 4.5，最適溫度95℃，活性不依賴于Ca2+存在，是一種高溫酸性α-淀粉酶，從熱穩(wěn)定性、最適pH和最適溫度等酶學特性綜合比較，其綜合性質均優(yōu)于其他突變體基因［12］，具有較大的應用潛力。

為了能達到生產(chǎn)的目的，本研究將密碼子優(yōu)化改造后的人工合成耐熱酸性α-淀粉酶基因BD5088在畢赤酵母中表達，獲得重組產(chǎn)物PrBD5088，并比較其與前期研究中相同基因在大腸桿菌原核表達產(chǎn)物ErBD5088 的酶學性質差異［13］。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

pPIC9K質粒、大腸桿菌 DH5α、受體菌 Pichia pastoris GS115細胞為本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌的培養(yǎng)和轉化使用LB培養(yǎng)基。酵母的培養(yǎng)、轉化、篩選和誘導表達使用YPD、MD、BMGY及BMMY等培養(yǎng)基，見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。鑒定淀粉酶活性的培養(yǎng)基是在BMMY培養(yǎng)基的基礎上添加1%淀粉和0.01%曲利苯蘭［14］。

1.1.3 試劑

限制性內切酶、T4DNA連接酶、Pyrobest DNA聚合酶、回收試劑盒、抗生素、DNA marker、蛋白質分子量標準，及其他化學試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司，PCR引物合成和測序由上海Sangon公司完成。

1.2 方法

1.2.1 分子克隆技術和表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

參照文獻［15］進行。

1.2.2 PCR引物合成和基因擴增

設計 引 物 P1、P2(5 ＇-GAATTCATTTGGTGGGACACGATTAGACA-3 ＇;5 ＇-GCGGCCGCACCAACACCACAGTAAGACCAAAC-3＇)擴增α-淀粉酶基因不含信號肽的結構基因。PCR擴增條件:94℃ 60 s，55℃ 60 s，72℃ 60 s，30 個循環(huán)。

1.2.3 重組質粒pPIC9K-BD5088的構建及轉化

以質粒 pET-BD5088［13］為模板，以 P1、P2 為引物，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)過EcoRI，NotI雙酶切連接至pPIC9K。用PCR、Bgl II酶切鑒定是否有外源基因的插入。重組質粒用Sal I酶切，回收大片段，經(jīng)電轉化法轉化到GS115中，涂MD平板，30℃培養(yǎng)。將用重組質粒轉化的轉化子定義為GS115/pPIC9KBD5088，同時用不含外源基因的pPIC9K質粒的轉化反應做對照，將其轉化子定義為GS115/pPIC9K(對照轉化子)。

1.2.4 含BD5088基因的重組畢氏酵母菌株的篩選

挑取轉化子單菌落到BMGY平板上培養(yǎng)48 h，然后再點接到含有1%淀粉的BMMY平板上，甲醇誘導(每塊平板每24 h補加250 μL甲醇)，通過單菌落在平板上產(chǎn)生的水解圈的大小來篩選重組畢赤酵母。

1.2.5 外源基因的誘導表達

將1株重組酵母轉化子GS115/pPIC9K-BD5088和GS115/pPIC9K按高密度搖瓶方式培養(yǎng)，挑取待表達的重組畢赤酵母單菌落于BMGY液體培養(yǎng)基，30℃，280 r/min，搖床培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600=2～6)，轉接1 mL培養(yǎng)液至100 mL BMGY液體培養(yǎng)基，30℃，280 r/min搖床培養(yǎng)至OD600達到20～30。室溫4 000 r/min離心5 min，收集菌體，去上清，細胞沉淀全部轉移至100 mL BMMY液體培養(yǎng)基中，25℃，280 r/min搖床培養(yǎng)。每隔24 h補加100%甲醇至終濃度為1%。每隔24 h取樣1 mL分析表達水平，以確定最佳誘導時間。

1.2.6 重組蛋白的SDS-PAGE分析和淀粉酶的活性染色

發(fā)酵液離心后取上清液，分離膠濃度為12%的SDS-PAGE電泳分離誘導產(chǎn)物，在分離膠中含有0.2%的可溶性淀粉。并用BandScan軟件分析重組蛋白表達量。電泳完畢后用酶活性測定緩沖液室溫振蕩洗膠1 h，更換新鮮緩沖液后37℃保溫過夜，將膠放入稀碘液顯色，在藍紫色背景可顯現(xiàn)酶蛋白降解淀粉形成的反白色條帶。

1.2.7 α-淀粉酶活力測定方法

純化后酶液用YOO改良法［16］測定酶活性。酶活性單位定義為在最適反應條件下，每分鐘水解1 mg的淀粉所需的酶量。

1.2.8 α-淀粉酶酶學性質研究

分別在30～100℃下測定活性確定其作用的最適溫度。分別在pH3.0～8.0的條件下測定酶活性，確定其作用的最適pH。向活性測定緩沖液中添加不同濃度的Ca2+、Cu2+和Zn2+，確定它們對活性的影響。分別在不同溫度、pH5.6條件下測定酶活性，確定其作用的最適溫度。將酶液在100℃條件下分別處理不同時間，冰浴后再測定殘留酶活性，評價酶的熱穩(wěn)定性。所有數(shù)據(jù)均為3次重復數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pPIC9K-BD5088的構建和鑒定

根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性，經(jīng)密碼子優(yōu)化設計，用基因合成法合成了來源于極端嗜熱古菌Thermococcus sp.中的超耐熱酸性 α-淀粉酶的基因BD5088，構建到原核表達載體pET－30a(+)，獲得質粒 pET-BD5088［13］。以 pET-BD5088 為模板，通過PCR反應得到了1.3 kb左右的DNA片段，與酶切后的pPIC9k質粒進行連接，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，堿法提取質粒。BglⅡ酶切質粒，產(chǎn)物約為1.8 kb和7.7 kb的兩個片段(圖1A)，而對照質粒酶切后只有一條帶。同時使用P1，P2引物進行PCR擴增，結果獲得大小約為1.3 kb的產(chǎn)物(圖1B)，進一步的測序結果表明，BD5088基因已正確插入。獲得的重組質粒命名為pPIC9K-BD5088。

(A)M:DNA Marker λ-EcoT14;1:pPIC9K 酶 切 產(chǎn) 物;2:pPIC9K-BD5088 酶切產(chǎn)物;(B)M:DNA Marker λ-EcoT14;1:pPIC9K-BD5088 PCR擴增產(chǎn)物

2.2 含BD5088基因的重組畢氏酵母的篩選

用SalⅠ酶切重組質粒pPIC9K-BD5088，使之線性化后轉化畢赤酵母GS115，先涂于MD平板培養(yǎng)48 h，然后再轉接到含有1%淀粉的BMMY平板上，甲醇誘導，部分菌落周圍出現(xiàn)明顯水解圈(圖2)。

圖2 BMMY淀粉平板鑒定菌落透明圈

2.3 酵母轉化子基因組PCR鑒定

分別提取了以重組質粒pPIC9K-BD5088轉化酵母得到的陽性轉化子(GS115/pPIC9K-BD5088)的基因組、以 pPIC9K轉化酵母得到的對照轉化子(GS115/pPIC9K)的基因組、宿主菌畢赤酵母(GS115)的基因組。分別以這3個基因組為模板，用擴增該基因時使用的5’及3’引物進行PCR鑒定。結果以陽性轉化子(GS115/pPIC9K-BD5088)基因組為模板的反應有1.3 kb左右的擴增產(chǎn)物出現(xiàn)，而以對照轉化子(GS115/pPIC9k)基因組和酵母GS115基因組為模板的反應均無擴增產(chǎn)物出現(xiàn)，可以證明酵母陽性轉化子(GS115/pPIC9K-BD5088)基因組中已整合了α-淀粉酶基因(見圖3)。

圖3 酵母轉化子基因組PCR鑒定

2.5 BD5088在畢氏酵母中的誘導表達和SDSPAGE分析

重組質粒與酵母細胞發(fā)生同源重組后可將外源基因整合到酵母染色體AOX1基因位點上去，該外源基因的表達受甲醇的嚴格調控和誘導。每隔24 h取樣1 mL，測定ɑ-淀粉酶活性，結果表明，在誘導培養(yǎng)的前3 d～5 d內，單位發(fā)酵液中的酶活力隨時間的增加基本上呈線性關系，在誘導后的第5 d分泌到培養(yǎng)液的酶活性最高(圖4)。第6 d后開始下降。

圖4 誘導時間與酶活性的關系曲線

將重組酵母GS115/pPIC9K-BD5088和對照轉化子GS115/pPIC9K誘導培養(yǎng)6 d，收集上清液，用于SDS-PAGE分析表達水平(圖5A)。用BandScan軟件掃描分析表明其表達量可達到約200 mg/L。將大腸桿菌表達的ErBD5088產(chǎn)物與畢赤酵母表達的重組酶PrBD5088進行比較，發(fā)現(xiàn)PrBD5088分子量約為55～60 ku，大于實際分子量48 ku。該蛋白可能由于受到糖基化的修飾，所以其電泳表觀分子量大于實際分子量?？紤]到BD5088的肽鏈中不存在能夠形成N-連接的任何潛在糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr，X是任意氨基酸)，推測畢赤酵母表達的PrBD5088為O-連接的糖基化蛋白?；钚匀旧Y果顯示，與PrBD5088條帶相應位置有一條亮帶，表明表達的產(chǎn)物具有淀粉酶水解活性(圖5B)。

(A)M:分子量標準;1:GS115/pPIC9K誘導表達后上清液;2～5:GS115/pPIC9K-BD5088誘導表達后上清液;(B)M:分子量標準;1:ErBD5088;2:PrBD5088;3:PrBD5088活性PAGE染色分析

2.6 PrBD5088酶學性質測定及其比較

在pH5.6的條件下，分別在30～100℃的條件下，測定PrBD5088的酶活力，如圖6所示，該酶的最適反應溫度為90℃，和ErBD5088相比，其最適反應溫度提高10℃。在80～95℃之間PrBD5088相對酶活保持在90%以上，在60～98℃相對酶活可保持在70%以上，而ErBD5088為65～85℃。

圖6 溫度對重組淀粉酶PrBD5088和ErBD5088的影響

在90℃條件下，分別在pH3～8的條件下，測定PrBD5088的酶活力，如圖7所示。該酶的最適pH為5.6，與 ErBD5088相同，但 PrBD5088的 pH范圍更寬，在pH5.0～6.5，相對酶活在90%以上，在pH4.0～8.0，內酶活性保留50%以上，而ErBD5088則只在pH5.0～7.0能維持活性的50%以上。

圖7 pH值對淀粉酶BD5088的影響

在活性測定緩沖液中加入不同濃度的ZnCl2、CuSO4、CaCl2進行酶活性測定，結果表明:隨著Cu2+濃度增加，PrBD5088活性逐漸得到抑制;Ca2+和Zn2+對維持rBD5088活性和穩(wěn)定性會產(chǎn)生輕微促進作用(圖8)。

圖8 金屬離子對PrBD5088酶活力的影響

對超高溫淀粉酶BD5088進行熱穩(wěn)定性分析，分別在100℃條件下，對酶加熱 5、10、20、30、60 min，然后在90℃下測其酶活(圖9)，在100℃條件下加熱60 min，酶活性仍可維持在原活性的80%以上，說明該酶有很好的熱穩(wěn)定性，并遠高于 ErBD5088。ErBD5088相同條件下的半衰期只有20 min。

圖9 重組淀粉酶PrBD5088和ErBD5088的熱穩(wěn)定性

糖基化作用一般會增加酶的熱穩(wěn)定性，本研究發(fā)現(xiàn)O-連接的糖基化對重組α-淀粉酶PrBD5088的熱穩(wěn)定性和最適作用溫度有影響。與該基因在E.coli表達的α-淀粉酶BD5088相比，100℃條件下熱穩(wěn)定性有顯著的提高。

3 討論

來源于Thermococcus sp.的α-淀粉酶由于其具有的耐熱及耐酸性質近來受到關注。由于極端嗜熱菌的密碼子偏好性與常溫菌差別很大，其中含有的大量的稀有密碼子，直接影響了這些蛋白在酵母菌中的表達水平。本研究利用人工合成方法，用畢赤酵母常用密碼子替換原有稀有密碼子，實現(xiàn)了密碼子優(yōu)化后的基因BD5088在畢氏酵母中的高效表達。該工程菌株表達產(chǎn)生的重組α-淀粉酶可以有效分泌到胞外，具有良好的熱穩(wěn)定性、耐熱耐酸性，并遠優(yōu)于原核表達的重組酶，在酸性環(huán)境更加穩(wěn)定。通過對酵母轉化子表達產(chǎn)物上清液蛋白SDS-PAGE分析，表達產(chǎn)生的蛋白表觀分子量超過理論分子量，原因可能是表達的外源蛋白經(jīng)過糖基化修飾而造成分子量的增加［17］。因此本重組菌株可以為工業(yè)化生產(chǎn)提供有價值的參考。

另外，由于PrBD5088其熱穩(wěn)定性和活力均不需Ca2+的保護，所以在液化的過程中無需添加Ca2+，也不用在下游的工藝中去除Ca2+，可以簡化生產(chǎn)工序，降低生產(chǎn)成本。

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