胡少春， 童先麗， 雷旦生

鮑曼不動(dòng)桿菌中16S r RNA甲基化酶基因的分布與耐藥性分析

胡少春， 童先麗， 雷旦生

目的分析湖北省腫瘤醫(yī)院臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥性，并研究其16S r RNA甲基化酶基因armA和rmtB的分布。方法收集該院2009年3月—2010年5月臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌，采用K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，用PCR法篩選16S r RNA甲基化酶基因armA、rmtB，并對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果56株鮑曼不動(dòng)桿菌中armA基因陽(yáng)性21株（37.5%），未檢出rmtB基因菌株。armA基因陰性菌株對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥率顯著低于armA基因陽(yáng)性菌株。結(jié)論近年來(lái)該院鮑曼不動(dòng)桿菌分離率逐年增高。16S rRNA甲基化酶基因armA在鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛存在，且對(duì)多種抗生素耐藥，應(yīng)引起臨床醫(yī)師高度關(guān)注。

鮑曼不動(dòng)桿菌； 16S r RNA甲基化酶基因； 氨基糖苷類(lèi)抗生素； 耐藥性

鮑曼不動(dòng)桿菌屬不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌，是醫(yī)院感染的重要病原菌。該菌廣泛分布于醫(yī)院環(huán)境中，在免疫力低下的患者中可引起嚴(yán)重感染，如肺炎、血流感染、腦膜炎等。隨著抗菌藥物的廣泛使用，多重耐藥（同時(shí)耐3種以上不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗菌藥物）的不動(dòng)桿菌的比率也在增加，并可造成醫(yī)院內(nèi)的暴發(fā)流行［1］，令抗感染治療非常困難。在2006—2007年Mohnarin細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中，鮑曼不動(dòng)桿菌在該類(lèi)菌中所占比率僅次于銅綠假單胞菌而位居第2位［2］。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)、β內(nèi)酰胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)等抗菌藥物出現(xiàn)多重耐藥［3］，尤其是在ICU、呼吸科、血液科病房引起的暴發(fā)流行，病死率很高，給臨床治療帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

氨基糖苷類(lèi)抗生素是治療鮑曼不動(dòng)桿菌所致的嚴(yán)重感染的最常用的藥物之一，在感染性疾病的治療中發(fā)揮著舉足輕重的作用。大量氨基糖苷類(lèi)抗生素在臨床上的應(yīng)用，也造成了一種選擇性壓力，促使新的耐藥基因產(chǎn)生。16S r RNA甲基化酶介導(dǎo)的對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥給臨床治療造成難題。本研究主要采用PCR技術(shù)篩查我院臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌中的16S r RNA甲基化酶armA和rmtB基因，以了解它們的分布情況。

材料與方法

一、材料

（一）菌株來(lái)源 收集我院2009年3月—2010年5月住院及門(mén)診患者送檢的痰、咽拭、引流液、中段尿、血、胸腹水及各種創(chuàng)面分泌物中分離出的鮑曼不動(dòng)桿菌共56株。

（二）抗菌藥物藥敏試驗(yàn)紙片和實(shí)驗(yàn)器材 阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素和奈替米星的藥敏試驗(yàn)紙片均購(gòu)于OXOID公司。ABI7000全自動(dòng)PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)PE公司。Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、d NTP、DNA marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；PCR引物由上海閃晶分子生物工程公司合成，各引物序列見(jiàn)表1。MH瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853。

二、方法

（一）細(xì)菌鑒定 用VITEK 32型全自動(dòng)微生物鑒定儀（法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品）進(jìn)行鑒定。

表1 PCR擴(kuò)增基因引物序列Table 1.The sequences of primers used for PCR amplification

（二）藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片擴(kuò)散法，將待檢菌稀釋成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木海鶆蛲坎加贛H平皿，待平皿稍干后貼藥敏試驗(yàn)紙片，每個(gè)紙片中心至少相距24 mm。藥敏試驗(yàn)結(jié)果按CLSI 2008年標(biāo)準(zhǔn)判讀［6］。

（三）模板制備 從血平皿上挑取3～4個(gè)菌落，加入0.85%氯化鈉溶液300μL，制成細(xì)菌懸液，混勻。10 000 r／min離心5 min，棄去上清液，加入無(wú)菌雙蒸水300μL，混勻。細(xì)菌懸液100℃，15 min水浴后，12 000 r／min離心2 min，棄去上清液，取底部沉淀作為DNA模板。

（四）PCR體系 反應(yīng)體系為50μL，含10×PCR buffer 5μL，d NTP 4μL，DNA模板3μL，上下游引物 （20 pmol）各 1μL，Taq 酶 （5 u／μL）0.25μL，d H2O 34μL。

（五）反應(yīng)條件［7］

1.armA：94℃變性5 min；94 ℃變性45 s，52℃退火1 min，72℃延伸1 min為1個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

2.rmtB：94℃變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min為1個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳觀察特異性擴(kuò)增條帶。

（六）DNA序列測(cè)序 由上海閃晶分子生物科技有限公司協(xié)助完成。

三、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用WHONET 5.4軟件及SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、藥敏試驗(yàn)結(jié)果

56株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)4種氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥率和敏感率見(jiàn)表2。

表2 鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)4種氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥率和敏感率（%）Table 2.Susceptibility of Acinetobacterbaumannii isolates to aminoglycosides（%）

二、16S r RNA甲基化酶基因的檢測(cè)

56株菌株中共有25株對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥，25株中armA基因陽(yáng)性者為21株，占耐藥株84.0%，未檢測(cè)到rmtB菌株。將基因測(cè)序結(jié)果與GenBankarmA基因（注冊(cè)號(hào)為AY220558）作BLAST分析，發(fā)現(xiàn)它們核苷酸的同源性為99%。

圖1 PCR擴(kuò)增armA基因產(chǎn)物電泳結(jié)果FIG.1.Electrophoretic analysis of arm A gene products of PCR amplification

討 論

長(zhǎng)期以來(lái)人們都認(rèn)為16S r RNA甲基化酶僅限于環(huán)境菌株［8］。2002年日本學(xué)者 Yokoyama等［9］對(duì)1株分離自1997年的銅綠假單胞菌的研究中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)阿貝卡星高度耐藥。阿貝卡星是卡那霉素的衍生物，1990年開(kāi)始在日本上市，對(duì)氨基糖苷鈍化酶穩(wěn)定，僅可為甲氧西林耐藥金葡菌（MRSA）產(chǎn)生的雙功能酶［AAC（6′）／APH（2″）］水解失活，但通常表現(xiàn)為低水平耐藥，說(shuō)明還可能存在其他耐藥機(jī)制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)銅綠假單胞菌對(duì)阿貝卡星高度耐藥的是一種新的氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥機(jī)制——16S r RNA甲基化酶（rmtA），并且該酶的編碼基因和超廣譜β內(nèi)酰胺酶CTX-M-3編碼基因位于同一接合性質(zhì)粒上［9］。此后不斷有新的16S r RNA甲基化酶在臨床致病革蘭陰性菌中被發(fā)現(xiàn)。2003年法國(guó)學(xué)者Galimand等［7］報(bào)道，從肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了另一種對(duì)多種氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥的16S r RNA甲基化酶armA。2004年日本，另一16S r RNA甲基化酶amtB從黏質(zhì)沙雷菌中克隆得到。

本實(shí)驗(yàn)采用PCR方法檢測(cè)2種16S r RNA甲基化酶基因arm A和rmt B。從56株鮑曼不動(dòng)桿菌中檢測(cè)到21株arm A基因陽(yáng)性菌，陽(yáng)性率為37.5%（21／56）。潘韻峰等［10］調(diào)查國(guó)內(nèi)6個(gè)省市（北京、上海、重慶、沈陽(yáng)、廣州、浙江）25所醫(yī)院鮑曼不動(dòng)桿菌菌株中，23所醫(yī)院檢測(cè)到armA基因，陽(yáng)性率達(dá)47.7%。朱健銘等［11］報(bào)道armA基因在浙江地區(qū)的流行，陽(yáng)性率達(dá)30.0%，低于本研究結(jié)果。我國(guó)大陸地區(qū)armA基因檢測(cè)陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于世界平均水平。國(guó)內(nèi)16S r RNA甲基化酶基因之所以陽(yáng)性率高，可能與以下因素有關(guān)：①醫(yī)院內(nèi)及醫(yī)院間的克隆播散已經(jīng)成為我國(guó)鮑曼不動(dòng)桿菌分離率不斷上升、菌株不斷增加的最主要原因［12］；②16S rRNA甲基化酶基因armA和rmtB可通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)播散導(dǎo)致革蘭陰性桿菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥并造成臨床耐藥菌株的傳播［13］；③由于臨床上氨基糖苷類(lèi)抗生素的不合理使用，加速了這種耐藥基因的產(chǎn)生和傳播。

表2顯示，不攜帶armA基因的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)阿米卡星、鏈霉素、慶大霉素、奈替沙星的耐藥率顯著低于攜帶armA基因的鮑曼不動(dòng)桿菌，說(shuō)明16S r RNA甲基化酶基因armA可導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的高度耐藥。耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在近10年迅速成為少數(shù)最為難治的病原菌，具有很強(qiáng)的醫(yī)院內(nèi)流行特性。因此有必要及時(shí)監(jiān)控鮑曼不動(dòng)桿菌及其耐藥特性，改進(jìn)和加強(qiáng)醫(yī)院內(nèi)預(yù)防與控制感染的措施，避免及減少醫(yī)務(wù)工作人員本身作為不應(yīng)該的傳播媒介。合理使用抗生素也是預(yù)防及減少醫(yī)院條件致病菌感染及耐藥性形成傳播的重要管理對(duì)策。

［1］ 王輝，陳民均.1994～2001年中國(guó)重癥監(jiān)護(hù)病房非發(fā)酵糖細(xì)菌的耐藥變遷［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2003，83（5）：385-385.

［2］ 肖永紅，王進(jìn)，趙彩云，等.2006-2007年Mohnarin細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18（8）：1501-1506.

［3］ 糜祖煌，黃支密，秦玲.鮑氏不動(dòng)桿菌耐藥性和氨基糖苷類(lèi)修飾酶、β內(nèi)酰胺酶基因研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2004，14（9）：968-971.

［4］ Yamane K，Wachino J，Suzuki S，et al.16S r RNA methylase-producing，gram-negative pathogens，Japan［J］.Emerg Infect Dis，2007，13（4）：642-646.

［5］ Doi Y，Yokoyama K，Yamane K，et al.Plasmid-mediated 16S rRNA methylaso in Sorratia mareeacens conferring high-level resistance to aminnglycesides［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（2）：491-496.

［6］ Clinical and Laboratory Standards Institute，performance standards for antimicrobial susceptibility testing；fifteenth informational supplement［S］.Wayne Pennsylvania：NCCLS document M100-S18，2008.

［7］ Galimand M，Courvalin P，Lambert T.Piasmid-mediated high-1evel resistance to aminoglycosides in Enterobacteriaceae due to 16S r RNA methylation［J］.Antimicrob Agents Chemother，2003，47（8）：2565-2571.

［8］ Holmes DJ，Cundliffe E.Analysis of a ribosomal RNA methylase gene fromStreptomycestenebrariuswhich confers resistance to gentamicin［J］.Mol Gen Genet，1991，229（2）：229-237.

［9］ Yokoyama K，Doi Y，Yamane K，et al.Genetic environments of the rmt A gene inPseudomonasaeruginosaclinical isolates［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（6）：2069-2074.

［10］ 潘韻峰，周華，周志慧，等.16S r RNA甲基化酶基因在鮑曼不動(dòng)桿菌中的分布［J］.中華傳染病雜志，2007，25（10）：593-596.

［11］ 朱鍵銘，姜如金，糜祖煌.多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌存在新的氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥機(jī)制［J］.世界感染雜志，2008，8（1）：20-23.

［12］ 尹冬虹，杜娟，段金菊，等.多重耐藥不動(dòng)桿菌16S r RNA甲基化酶和同源性研究［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，32（6）：673-377.

［13］ 吳蓉，張隆，戴俊華，等.革蘭陰性桿菌16S r RNA甲基化酶基因檢測(cè)及作用研究［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，25（6）：423-426.

The prevalence of 16S r RNA methylase gene and drug resistance analysis inAcinetobacterbaumannii

HUShaochun，TONGXianli，LEIDansheng. （DepartmentofClinicalLaboratory，CancerHospital ofHubeiProvince，HubeiWuhan430079，China）

ObjectiveTo analyze the resistance ofA.baumanniito aminoglycoside antibiotics and investigate the prevalence of 16S r RNA methylase genearm Aandrmt B.MethodsClinical isolates ofA.baumanniiwere collected from patients in Cancer Hospital of Hubei Province from March 2009 to May 2010.The size of inhibitory zone of these strains was determined using Kirby-Bauer（K-B）method.The 16S r RNA methylase genesarmAandrmtBwere detected by PCR.The positive PCR-products were purified for sequencing analysis.ResultsThearm Agene was positive in 21（37.5%）of the 56A.baumanniistrains.However，rmtB-positive isolate was not identified.Thearm A-negative isolates were much less resistant than the correspondingarm A-positive strains.ConclusionsThe prevalence of aminoglycosides-resistantA.baumanniiis increasing in our hospital in recent years.The 16S r RNA methylase genearmAis widely present inA.baumanniiisolates.Such isolates are highly resistant to multiple antibiotics，which may become a clinical concern.

Acinetobacterbaumannii； 16S r RNA methylase gene； aminoglycoside； resistance

R378

A

1009-7708（2012）06-0446-03

湖北省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430079。

胡少春（1973—），女，主管技師，學(xué)士，主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。

胡少春，E-mail：334646547＠qq.com。

2012-04-01

·論著·