羅淑青， 卓開華， 周 征， 曹 琳

(寧波市食品藥品檢驗(yàn)所，浙江寧波315048)

甘氨雙唑鈉為一種放射增敏藥，體內(nèi)外研究表明:其對(duì)S180腫瘤、食道癌、鼻咽癌、B16黑色素瘤和EMT6乳腺癌等均有較好的放射增敏效果［1-3］。該藥于1983年由第二軍醫(yī)大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所立項(xiàng)研究，1993年9月由國(guó)家專利局授予發(fā)明專利權(quán)，并于2002年獲得原SDA頒發(fā)的一類新藥證書和生產(chǎn)批文，由廣州萊泰制藥有限公司獨(dú)家生產(chǎn)上市，商品名為希美納，后于2007年轉(zhuǎn)讓給山東綠葉制藥有限公司。該藥生產(chǎn)過(guò)程(包括合成、結(jié)晶)中需使用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇等有機(jī)溶劑，而根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)頒布的《化學(xué)藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中的要求，合成工藝中用到的二類溶劑需進(jìn)行殘留溶劑檢測(cè)。國(guó)家現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)［WS1-(X-020)-2007Z］規(guī)定采用直接進(jìn)樣法檢測(cè)其乙醇?xì)埩袅浚形匆?guī)定對(duì)DMF進(jìn)行檢測(cè)，考慮到后者對(duì)人體的危害［4］，本文建立了氣相色譜法以檢查殘留溶劑DMF和乙醇含量，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

1 儀器與試劑

Agilent 7890N型氣相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，配Agilent7683型自動(dòng)進(jìn)樣器和Chemstation工作站。

甘氨雙唑鈉(山東綠葉制藥有限公司提供，批號(hào):091212;091216;100307);二甲基亞砜(DMSO，色譜純，美國(guó)天地試劑公司，批號(hào):905033);DMF (色譜純，美國(guó)天地試劑公司，批號(hào):912321);乙酸乙酯(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào): 10010320);無(wú)水乙醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20110221)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:HP-FFAP毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm);柱溫:程序升溫，初始溫度40℃保持5 min，以每分鐘8℃的升溫速率升至110℃，保持2 min，然后以每分鐘30℃的升溫速率升至230℃，保持2 min。載氣:高純N2，流速:3.0 mL·min－1，分流比:10∶1，進(jìn)樣口溫度:230℃;檢測(cè)器溫度: 250℃;進(jìn)樣量:1μL。

2.2 溶液的制備

內(nèi)標(biāo)貯備液的制備:取乙酸乙酯約1.0 g，精密稱定，置事先加入適量DMSO的200 mL量瓶中，加DMSO溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含乙酸乙酯5 mg的內(nèi)標(biāo)貯備液。

乙醇貯備液的制備:取乙醇約250.0 mg，精密稱定，置事先加入適量DMSO的50 mL量瓶中，加DMSO溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含乙醇5 mg的對(duì)照品貯備液。

DMF貯備液的制備:取DMF約44.0 mg，精密稱定，置事先加入適量DMSO的50 mL量瓶中，加DMSO溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含DMF 880μg的對(duì)照品貯備液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取DMSO 1μL進(jìn)樣，結(jié)果表明空白對(duì)測(cè)定無(wú)干擾［見圖1(A)］。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取乙醇貯備液和DMF貯備液各5.0 mL，置事先加入適量DMSO的50 mL量瓶中，加內(nèi)標(biāo)貯備液5.0 mL，再加DMSO稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，各組分的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于5 000［見圖1(B)］。

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取乙醇貯備液0.05、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 mL，DMF貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0和10.0mL，分別置事先加入適量DMSO的50 mL量瓶中，并分別加內(nèi)標(biāo)貯備液5.0 mL，再加DMSO稀釋至刻度，搖勻，分別得每1 mL含乙醇 5.0、10.0、50.0、100.0、500.0、1 000.0μg和每1 mL含DMF 8.8、17.6、35.2、52.8、88.0、176.0μg的對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，分別以對(duì)照液峰面積與內(nèi)標(biāo)液峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得乙醇回歸方程為: Y=0.002 2 X－0.008 1(r=0.999 8);DMF回歸方程為:Y=0.001 5 X－0.001(r=1.000 0)。結(jié)果表明:乙醇和DMF在上述質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰面積之比與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度與穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液乙醇(500 mg·L－1)和DMF (88.00 mg·L－1)，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果，其峰面積RSD分別為0.15%和0.73%(n=5)，表明精密度符合藥典要求;同時(shí)，在2、8、14、20、26 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，得乙醇和DMF峰面積RSD分別為1.55%和1.15%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取甘氨雙唑鈉9份，每份1.0 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加適量DMSO使溶解，分別精密加入乙醇和DMF貯備液各0.8、1.0和1.2 mL，加入內(nèi)標(biāo)貯備液1.0 mL，并稀釋至刻度，進(jìn)樣，根據(jù)峰面積比計(jì)算回收率。乙醇及DMF平均回收率分別為98.00%和97.32%(n=9);RSD分別為0.64%和0.12%(n=9)。

2.8 最低檢出濃度

由混合對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，直到峰高的信噪比(S/N)為3，得乙醇和DMF最低檢出質(zhì)量濃度分別為2.5和4.4 mg·L－1。

2.9 樣品測(cè)定

取3個(gè)批號(hào)(批號(hào):091212;091216;100307)的甘氨雙唑鈉樣品各約1.0 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加適量DMSO使溶解，加內(nèi)標(biāo)貯備液1.0 mL，并稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果DMF未檢出，乙醇有殘留［見圖1(C)］。按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比計(jì)算得3批樣品中乙醇?xì)埩袅糠謩e為0.44%、0.46%和0.46%。

圖1 空白溶液(A)、混合對(duì)照品溶液(B)和供試品溶液(C)的色譜圖Figure 1 Chromatograms of blank solution(A)，mixed standard solution(B)and sample solution(C)of glycididazole sodium

3 討論

DMF的沸點(diǎn)高，不宜采用頂空進(jìn)樣法測(cè)定，根據(jù)中國(guó)藥典中關(guān)于殘留溶劑測(cè)定的指導(dǎo)建議，本實(shí)驗(yàn)采用直接進(jìn)樣法測(cè)定此類沸點(diǎn)較高的溶劑。甘氨雙唑鈉在水中易溶，但為保護(hù)色譜柱應(yīng)盡量避免以水為溶劑，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以DMSO作為溶劑，也可將甘氨雙唑鈉完全溶解，且無(wú)基質(zhì)效應(yīng)，回收率好，故選擇DMSO作為溶劑。

待測(cè)的有機(jī)殘留溶劑為樣品中微量的揮發(fā)性物質(zhì)，且乙醇?xì)埩袅繉⒃诟拾彪p唑鈉含量計(jì)算時(shí)予以扣除，采用內(nèi)標(biāo)法定量可減少由儀器系統(tǒng)或操作過(guò)程帶來(lái)的誤差。

在摸索色譜條件時(shí)，分別試用了HP-1、DB-624、HP-FFAP這3種型號(hào)的毛細(xì)管柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HP-1型毛細(xì)管柱上，2種溶劑和內(nèi)標(biāo)物乙酸乙酯均能較好分離，但柱效均不高;在DB-624型毛細(xì)管柱上，程序升溫造成基線抬高，從而導(dǎo)致分離效果欠佳。在HP-FFAP型毛細(xì)管柱上，本實(shí)驗(yàn)曾試圖通過(guò)增加程序升溫速率來(lái)縮短DMF的保留時(shí)間，結(jié)果其在抬高的基線上出峰，致柱效下降，且對(duì)樣品測(cè)定造成影響，無(wú)法判斷有無(wú)溶劑殘留以及空白溶劑是否有干擾;提高初始溫度則導(dǎo)致乙醇與乙酸乙酯的分離度降低，不符合檢測(cè)要求，最終通過(guò)改變程序升溫的條件延長(zhǎng)了 DMF的出峰時(shí)間，很好地解決了上述問(wèn)題。

該法適用于甘氨雙唑鈉原料藥中乙醇和DMF殘留量的內(nèi)標(biāo)法測(cè)定。

［1］ 劉昌孝，魏廣力，肖淑華.甘氨雙唑鈉在大鼠和小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000，35(10):770-773.

［2］ 劉孟忠，盧泰祥，胡永紅.甘氨雙唑鈉對(duì)鼻咽癌放療增敏作用的臨床研究［J］.中國(guó)腫瘤臨床與康復(fù)，2003，10(3):199-202.

［3］ 王鳳英，孫菁，鮑云華，等.甘氨雙唑鈉對(duì)食道癌放射治療增敏作用的研究［J］.中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2001，8(4): 369-370，372.

［4］ 夏元洵.化學(xué)物質(zhì)毒性全書［M］.上海:上?？萍汲霭嫔?，1991:456.