孟 潔 付 麗

AR基因位于X染色體的長臂上(Xq11-12)，包括8個外顯子并編碼919個氨基酸及殘基的蛋白質(zhì)，其在諸多臨床疾病中值得研究。在AR基因外顯子1中包含高度的[CAG]n重復(fù)多態(tài)性，對于乳腺癌短重復(fù)長度發(fā)病危險下降。本文設(shè)立乳腺癌病例組和健康對照組，PCR擴增AR外顯子1的CAG重復(fù)序列，比較兩組的長度差異，初步探討AR基因外顯子1 CAG重復(fù)多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科2008年6月～9月收治的50例乳腺癌患者及50例健康對照者，無血緣關(guān)系，50例術(shù)后病理組織學(xué)診斷為乳腺癌，另50例術(shù)后診斷為良性病變。病例組中7例(7/50，14.0%)至少有一個一級親屬患乳腺癌，對照組中2例(2/50，4.0%)有乳腺癌家族史。病理類型主要為浸潤性導(dǎo)管癌。

1.2 方法

外周血標本分別編號置于無菌凍存管中，立即放入-180℃液氮中，而后轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

組織基因組DNA的提?。夯蚪MDNA是從外周血淋巴細胞通過E.Z.N.A.Tissue DNA Kit試劑盒提取的。

DNA體外擴增——聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)：一對正義和反義寡核苷酸引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。外顯子1上游引物序列：5' GTG GAA GAT TCA GCC AAG CTC 3'；下游引物序列：5' TTG CTG TTC CTC ATC CAG GAC 3'。反應(yīng)體系25 μl，條件為預(yù)變性95℃ 4 min、94℃ 45 s、66.6℃ 30 s、72℃ 30 s，完成35個循環(huán),最終延伸72℃ 7 min,4℃保存。

DNA序列測定：取PCR產(chǎn)物10 μl送至上海申能博彩生物科技有限公司，完成DNA純化及DNA直接序列測定，計算重復(fù)頻率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

比較CAG重復(fù)長度及平均重復(fù)長度,在所有可能的分界點，將長度以二分法分類，采用χ2和Fisher精確檢驗比較。Wilcoxon rank test 檢驗兩組[CAG]n分布；將重復(fù)頻率分為≤20、≤21、≤22、≤23、≤24、≤25、≤26幾組，采用多因素log回歸分析CAG重復(fù)頻率對乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的評估，α=0.05，采用SPSS11.0完成。

2 結(jié)果

病例組發(fā)病年齡43～56歲，中位年齡為50歲，對照組年齡46～62歲，中位年齡為53歲。兩組年齡分布無差異(P=0.06)。 病例組中7例 (7/50，14.0%)有乳腺癌家族史，對照組中2例(2/50，4.0%) 有乳腺癌家族史，兩組比較無差異(P=0.16)。

病例組CAG重復(fù)頻率為15～26(中位數(shù)23)，對照組CAG重復(fù)頻率為16～26(中位數(shù)22)，例如：AGGGGAGGGAGTTAGGGCTGGGAGGGTCTACCCTCGGCCGCCGTCCAAGACCTACCGAGGAGCTTTCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGCGCGAAGTGATCCAGAACCCGGGCCCCAGGCACCCAGAGGCCGCGAGCGCAGCACCTCCCGGCGCCAGTTTGCTGCTGCTGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGAATCACCACCAGCAGCATCACCCCCAGCAGGAGGAGGATGGTTCTCCCGAGGATGGTCCTCCACGCCCCCCTCGCTAACTGCCCCTGGATGAGGTGCAGCAGAATGAGGAACAGCAAAAGCA。Wilcoxon rank 檢驗兩組[CAG]n分布有差異(統(tǒng)計量為2.426，P=0.015)(圖1)。

CAG重復(fù)頻率與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險分析結(jié)果：當(dāng)[CAG]n分界點為24時，P<0.05，即重復(fù)頻率≥24，乳腺癌發(fā)病風(fēng)險為重復(fù)頻率≤20的5.6倍 (表1)。

圖1 兩組CAG重復(fù)頻率

表1 CAG重復(fù)頻率對乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的評估

3 討論

內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的性激素對乳腺癌發(fā)生有促進作用，大部分乳腺組織表達ER、PR、AR，性激素通過這些受體發(fā)揮作用[1]。在乳腺組織中AR與乳腺細胞的分化、生長相關(guān)。雄激素可通過轉(zhuǎn)化為雌二醇、與激素結(jié)合蛋白競爭，或直接與AR結(jié)合，來影響乳腺細胞生長。對于乳腺癌，短重復(fù)長度發(fā)病危險下降， AR基因CAG重復(fù)長度增加，AR基因轉(zhuǎn)錄能力下降，AR活性降低，使雄激素在乳腺組織中通過AR發(fā)揮抗有絲分裂能力下降，促進乳腺癌發(fā)生，乳腺癌發(fā)病風(fēng)險提高。

有研究表明[2]，多因素COX回歸分析AR(+)預(yù)后良好，可作為輔助預(yù)后因子，進一步分析在預(yù)后相對較差的淋巴結(jié)受累及HER2表達陽性患者中，AR表達對預(yù)后的進一步分析有價值，即AR(+)預(yù)后好于AR(-)。

AR基因外顯子1 CAG重復(fù)長度因人群而異，一般重復(fù)長度10～40。同時分析界點的不同，亦有人種差異。Giguere等[3]雖然發(fā)現(xiàn)CAG重復(fù)長度與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險呈負相關(guān),但基因型分界點不同,當(dāng)OR=0.5時,CAG分界點為≤20；Elhaji等[4]研究認為CAG重復(fù)≥26則乳腺癌發(fā)病風(fēng)險提高了2.4倍，還有部分學(xué)者亦發(fā)現(xiàn)長的[CAG]n與乳腺癌發(fā)生相關(guān)[5，6]。

同時也有文章持相反結(jié)論，Spurdle 等[7，8]分析了368例乳腺癌和284例對照組，未發(fā)現(xiàn)[CAG]n≤22與乳腺癌發(fā)生有關(guān)。Christopher 等雖無陽性發(fā)現(xiàn)，但在具有一級乳腺癌家族史的女性中長[CAG]n會增大乳腺癌發(fā)病風(fēng)險。

因此，總結(jié)既往文獻，歐美文獻表明長[CAG]n與乳腺癌風(fēng)險增大相關(guān)，亞洲大多研究顯示兩者無關(guān)[9],結(jié)論相反的原因之一是患者種族不同。

本文結(jié)果表明，50例病例組和50例對照組CAG重復(fù)頻率分布有差異，并且當(dāng)分界點為24時，即[CAG]n≥24的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險為≤20的5.6倍。由于本文例數(shù)較少，未進一步分析年齡及家族史因素。

從某方面講，乳腺癌風(fēng)險可能與雄激素的活性相關(guān)，由于AR基因中包含高度的[CAG]n重復(fù)序列，其編碼谷氨酰胺合成酶束，此束道長度越短，AR轉(zhuǎn)錄能力越強，雄激素與AR親和力越強，雄激素效應(yīng)越強，因此，短[CAG]n者乳腺癌發(fā)病風(fēng)險顯著下降[10]。

總之，無論從先期研究中AR對乳腺癌的預(yù)后價值，抑或CAG重復(fù)頻率與乳腺癌的關(guān)系，我們認為，AR外顯子1的三核苷酸重復(fù)長度與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，下一步工作是闡明雄激素與AR通過何種機制影響乳腺上皮細胞增殖及導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生。

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