施煜,楊建英,朱虹,鄭曉冰,趙質(zhì)創(chuàng),韓飛

（汕頭市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站（汕頭）， 廣東汕頭 515041）

GPC-HPLC-RP法檢測(cè)熏燒烤肉制品中的苯并（a）芘

施煜,楊建英,朱虹,鄭曉冰,趙質(zhì)創(chuàng),韓飛

（汕頭市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站（汕頭）， 廣東汕頭 515041）

采用MPS全自動(dòng)樣品凈化系統(tǒng)中的GPC凝膠滲透色譜凈化熏燒烤肉制品中的苯并（a）芘 （BaP），并用高效液相色譜熒光法（HPLC-RP）測(cè)定BaP的含量。GPC條件：GPC凝膠滲透色譜柱，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（體積比50︰50）為流動(dòng)相，流速 4.7 mL/min，收集時(shí)間為 15～21 min。HPLC 條件：Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（體積比88︰12），流速為1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；激發(fā)波長(zhǎng)：384 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：406 nm。該方法線性關(guān)系良好，加標(biāo)回收率為 82.4%～91.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，檢出限為0.15 μg/kg。方法簡(jiǎn)化了手工操作，有效地去除了熏燒烤肉制品中的色素及脂肪干擾，可應(yīng)用于熏燒烤肉制品中BaP的測(cè)定。

苯并（a）芘；GPC；高效液相色譜；熏燒烤肉制品

熏燒烤肉是深受消費(fèi)者喜愛的傳統(tǒng)肉制品，在我國(guó)肉制品體系中占有重要地位，而熏燒烤肉制品中的苯并（a）芘（BaP）污染，是造成人體中BaP危害的主要來源。BaP是由5個(gè)苯環(huán)構(gòu)成的多環(huán)芳烴，是一種公認(rèn)的強(qiáng)致癌物，已成為環(huán)境污染中的重要監(jiān)測(cè)物質(zhì)[1,2]。BaP能夠引起皮膚、肺、食道等部位的腫瘤和癌變，廣泛存在于水、大氣、土壤、動(dòng)物和植物中，尤其是當(dāng)熏、燒、烤畜肉、禽肉和水產(chǎn)品類等食物時(shí)，肉制品中BaP的含量會(huì)急劇升高，其原因是在加工過程中肉類本身會(huì)生成BaP，加工過程中也易受到煙灰等污染[3,4]。目前，BaP對(duì)食品的污染已受到世界各國(guó)的重視，許多國(guó)家都制定了食品中的BaP限量。我國(guó)GB 2726-2005 《熟肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了BaP在肉制品中的殘留應(yīng)在5 μg/kg 以下。

但由于肉制品中BaP 含量低、樣品基體復(fù)雜、干擾成分多，因此分析測(cè)定難度較大。目前我國(guó)主要依據(jù)GB/T 5009.27-2003 《食品中苯并（a）芘的測(cè)定》，采用熒光分光光度法和目測(cè)比色法進(jìn)行分析，但這兩種方法分析時(shí)間長(zhǎng)，操作過程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)、費(fèi)溶劑、溶劑毒性大、準(zhǔn)確度較低，尤其是在濾紙上點(diǎn)樣和展開時(shí)，存在樣品斑點(diǎn)擴(kuò)散大、濾紙背景干擾等問題，導(dǎo)致難以觀測(cè)到所要取用的熒光斑點(diǎn)。我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1666-2008 《肉制品中苯并(а)芘的測(cè)定 高效液相色譜法》，采用高效液相色譜法進(jìn)行分析，該法分離效果好、檢出限低，但是存在樣品回收率低等問題。國(guó)外主要應(yīng)用高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，這些方法靈敏度高、回收率好[5]。

目前，由于檢測(cè)技術(shù)差異造成的技術(shù)壁壘嚴(yán)重影響了我國(guó)熏燒烤肉制品的出口，因此對(duì)熏燒烤肉制品中殘留及檢測(cè)技術(shù)的研究不僅是食品安全性研究的一個(gè)重要方面，更是提高國(guó)產(chǎn)肉制品質(zhì)量，擴(kuò)大出口所面臨的技術(shù)難題。筆者采用AccuPrep MPS全自動(dòng)樣品凈化系統(tǒng)中的GPC凝膠滲透色譜凈化熏燒烤肉制品中的 BaP，利用高效液相色譜熒光法（HPLC-RP）檢測(cè) BaP含量，取得了較滿意的效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1200型，配熒光檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司；

凝膠滲透色譜及在線濃縮儀： AccuPrep MPS GPC型，美國(guó)J2 Scientific公司；

環(huán)己烷、正己烷、石油醚、二氯甲烷、苯、二甲基亞砜、乙酸乙酯、甲醇、乙腈：色譜純，美國(guó)Tedia公司；

苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；

濾膜：0.22 μm，有機(jī)相；

實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 GPC 條件

GPC凝膠滲透色譜柱（P/N: C0785）；流動(dòng)相：環(huán)己烷-乙酸乙酯（體積比50∶50），流速：4.7 mL/min。

1.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（ 250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（體積比88∶12），流速為1.0 mL/min ；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL ；激發(fā)波長(zhǎng)：384 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：406 nm。

1.4 樣品前處理

稱取均勻粉碎試樣約5 g，置于50 mL離心管中，加入15 mL環(huán)己烷，渦旋處理1 min，超聲提取15 min，以4 200 r/min離心5 min，收集上清液。殘?jiān)謩e用10 mL環(huán)己烷重復(fù)提取2次，合并環(huán)己烷提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，定容至5 mL后，與5 mL乙酸乙酯混勻。取5 mL混合液，過AccuPrep MPS GPC凈化系統(tǒng)，定時(shí)收集的凈化液經(jīng)在線濃縮系統(tǒng)濃縮至2 mL，氮吹干燥，用1 mL甲醇溶解，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，供HPLC-RP檢測(cè)分析。

1.5 加標(biāo)回收率及檢出限的測(cè)定

稱取均勻粉碎試樣約2 g，添加適量的BaP標(biāo)準(zhǔn)品，混勻，按1.2～1.4進(jìn)行操作。對(duì)添加低濃度水平的BaP標(biāo)準(zhǔn)品的熏肉進(jìn)行測(cè)定，得到方法的檢出限。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

實(shí)驗(yàn)選用正己烷、環(huán)己烷、石油醚、二氯甲烷、苯、二甲基亞砜6種溶劑作提取劑，比較了6種溶劑的提取效率，結(jié)果表明環(huán)己烷的提取效率最高，經(jīng)過3次超聲提取，樣品中的BaP提取率可達(dá)90%以上。

2.2 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相是HPLC檢測(cè)樣品中操作條件的關(guān)鍵因素。通過比較乙腈-水和甲醇-水的不同配比分別作為流動(dòng)相，結(jié)果顯示，當(dāng)使用乙腈-水體積比為88∶12時(shí)，不僅BaP的保留時(shí)間適宜,峰形良好，而且基線穩(wěn)定、靈敏度高，與樣品中干擾物能達(dá)到較好的基線分離。

2.3 檢測(cè)器的選擇

BaP在紫外和熒光下都有吸收峰，但熒光檢測(cè)器只對(duì)帶熒光基團(tuán)的物質(zhì)有響應(yīng)，因此可有效去除那些不帶有熒光基團(tuán)的雜質(zhì)對(duì)樣品測(cè)定的干擾，大大提高BaP的檢測(cè)靈敏度，故實(shí)驗(yàn)采用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

由于大多數(shù)有熒光的化合物在230 nm波長(zhǎng)下都能被激發(fā)，因此在230 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下選擇多波長(zhǎng)發(fā)射，發(fā)現(xiàn)406 nm為最佳發(fā)射波長(zhǎng)。在固定406 nm發(fā)射波長(zhǎng)后選擇多波長(zhǎng)激發(fā)，最終選擇激發(fā)波長(zhǎng)384 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為406 nm。在此條件下，BaP標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖見圖1。

圖1 BaP標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖

2.4 GPC條件的選擇

將BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)GPC過柱，進(jìn)樣量為5 mL，流動(dòng)相為環(huán)己烷-乙酸乙酯（體積比1∶1），觀察BaP的紫外掃描圖，發(fā)現(xiàn)BaP的流出時(shí)間主要集中在16～20 min，故選擇收集時(shí)間為15～21 min。通過高效液相色譜檢測(cè)烤肉樣品，研究發(fā)現(xiàn)，GPC可將BaP從復(fù)雜基質(zhì)中凈化出來，能有效去除烤肉制品中大量的脂肪及其它脂溶類物質(zhì)。

2.5 線性關(guān)系與檢測(cè)限

對(duì)BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋后，配制濃度為2.5，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積A對(duì)BaP濃度c（μg/L）進(jìn)行線性回歸，得線性方程為A=1.131 3c+2.213 8，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 85。根據(jù)對(duì)添加低濃度水平的BaP樣品的測(cè)定，以10倍信噪比計(jì)算檢出限，方法的檢出限為0.15 μg/kg。

2.6 加標(biāo)回收率和精密度

為了計(jì)算檢測(cè)方法的回收率和考察方法的精密度，向烤肉和熏肉樣品中分別加入兩種不同濃度BaP標(biāo)樣（見表1），利用GPC凈化處理樣品，并采用HPLC-RP法進(jìn)行檢測(cè)。

表1 精密度及回收試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

結(jié)果顯示，選定的樣品預(yù)處理方法，使樣品得到了很好地凈化，且樣品中BaP的加標(biāo)回收率均在80%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于5%，符合食品檢驗(yàn)分析的要求。

3 結(jié)語(yǔ)

通過AccuPrep MPS全自動(dòng)樣品凈化系統(tǒng)中的GPC凝膠滲透色譜有效地去除了熏燒烤肉制品中的色素及脂肪干擾，簡(jiǎn)化了手工操作過程，有效地去除了熏燒烤肉制品中的各種干擾物，簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地測(cè)定了熏燒烤肉制品中苯并（a）芘的含量。

[1]李偉紅，戴廷燦，周瑤敏，等. 高效液相色譜法測(cè)定熟肉制品中的苯并（a）芘[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 20(1): 86-88.

[2]吳海智, 周叢, 袁列江，等. 高效液相色譜法快速測(cè)定植物油中苯并（a）芘的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(1): 6 075-6 076.

[3]劉福嶺, 戴行均. 食品物理與化學(xué)分析方法[M]. 北京: 輕工業(yè)出版社, 1987: 41l-425.

[4]田曉玲, 柏云江. 高效液相色譜法測(cè)定飼料中的苯并（a）芘[J].飼料工業(yè), 2005, 26(1): 53-54.

[5]Meudec A, Dussauze J, Jourdin M, et al. Gas chromatographic-mass spectrometric method for polycyclic aromatic hydrocarbon analysis in plant biota[J]. Journal of Chromatography, 2006, 1 108(2):240-247.

Determination of Benzo (a) Pyrene in Smoked Barbecue Meat Products by GPC-HPLC-RP

Shi Yu, Yang Jianying, Zhu Hong, Zhen Xiaobing, Zhao Zhichuang, Han Fei
[Shantou Institute of Quality and Metrology Supervision Testing, Guangdong Food Supervision Inspection Station (Shantou),Shantou 515041, China]

A method for quantitative detection of benzo (α) pyrene in smoked barbecue meat products by GPC of Accu Prep MPS and HPLC-RP was established. GPC conditions: gel permeation chromatography (GPC) was selected;mobile phase was cyclohexane-ethyl acetate (50∶50), flow rate was 4.7 mL/min, and collection for 15-21 min. HPLC conditions:Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm), flow rate was 1.0 mL/min, mobile phase was acetonitrile-water(88∶12), column temperature was 30℃ , sampling volume was 10 μL, excitation wavelength was 386 nm and emission wavelength was 406 nm. The results showed that the standard curve of BaP had good linearity, the recovery rate was 82.4%－91.3%, the relative standard deviation was less than 5%, and the detection limit was 0.15 μg/kg. In this method,the manual operation was simplified, and the interference of pigment and fat were apart from smoked barbecue meat products. The method may be applied to determine the BaP in smoked barbecue meat products.

benzo (a) pyrene; GPC; high performance liquid chromatography; smoked barbecue meat products

O656.31

A

1008-6145(2012)01-0052-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2012.01.016

聯(lián)系人：韓飛；E-mail:fei.han@163.com

2011-10-18