徐金瑞,楊 易,周 晶，孫晶瑩

(寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川 750021)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)屬自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥性病變。在我國，RA患病率為0.3%，嚴重時會導(dǎo)致勞動力喪失或致殘[1]。遺傳與環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致RA發(fā)生。雙胞胎RA患病率高于普通人群，且RA具有輕度的家族聚集傾向，均表明遺傳因素參與了RA發(fā)病[2]。2001年，McIntire等[3]在研究哮喘基因中發(fā)現(xiàn)一個新的基因家族，即T細胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，Tim)。人類Tim基因位于5q33.2上，目前已確定有Tim-1，Tim-3及Tim-4 3個成員。Tim-4主要表達于成熟的樹突狀細胞、巨噬細胞的細胞膜表面[4]，通過與其受體Tim-1相結(jié)合發(fā)揮作用，促進Th2細胞的分化與增殖，對一些免疫性疾病產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[5]。由于歷史上禁止與異族通婚，寧夏回族人群形成了遺傳學(xué)上的“隔離人群”。已有研究表明，寧夏回族具有特殊的遺傳結(jié)構(gòu)，與漢族及其他民族間存在差異[6]。目前，國內(nèi)外尚未見有關(guān)Tim-4基因多態(tài)性與RA關(guān)聯(lián)性的研究報道。本研究對寧夏地區(qū)回族人群Tim-4基因rs7700944位點的多態(tài)性進行分析，探討該位點的變異與寧夏地區(qū)回族人群RA發(fā)生的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據(jù)知情同意原則，收集寧夏不同地區(qū)回族人群外周靜脈血樣本，RA患者210例，健康個體198名。個體間無血緣關(guān)系，追溯3代均為同一民族，且在寧夏居住3代以上。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 采用常規(guī)的酚/氯仿提取法提取基因組DNA，并溶于TE緩沖液中備用。

1.2.2引物 參照GeneBank中Tim-4基因序列及相關(guān)文獻設(shè)計合成引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，上游引物：5′-CTT AGC TGG CTT AGG AGT AGC-3′，下游引物： 5′-GGT CCA CGA TAA AGG AGA AA-3′。

1.2.3PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系25 μL：DNA模板(40 ng/μL)1 μL，引物P1、P2各1 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，Taq DNA聚合酶(1 U/μL)0.2 μL，Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL，滅菌三蒸水16.8 μL。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)為94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s。最后在72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物3 μL，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。

表1 兩組rs7700944位點多態(tài)性分布[n(%)]

1.2.4限制性內(nèi)切酶酶切 采用SacⅠ限制性內(nèi)切酶(購自美國NEB公司)對PCR產(chǎn)物進行酶切，反應(yīng)體系10 μL：PCR產(chǎn)物3.5 μL，10×酶切緩沖液1 μL，限制性內(nèi)切酶2 U，用滅菌三蒸水補齊至10 μL。經(jīng)37 ℃酶切2～3 h，產(chǎn)物經(jīng)8%非變性凝膠電泳分離。

1.2.5基因型的記錄與分析 各樣本的基因型判定根據(jù)酶切結(jié)果：AG為298、200、98 bp，GG為：200、98 bp，AA為298 bp。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，基因型頻率、等位基因頻率在兩組中頻率分布的差異及Hardy-Weinberg平衡檢驗均采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PCR結(jié)果 擴增出的目的片段大小為298 bp，見圖1。

2.2酶切結(jié)果 rs7700944位點檢出3種基因型：GG，AA和GG，見圖2。

M：DNA標(biāo)記物；1～5：PCR產(chǎn)物。

M：DNA標(biāo)記物；1、3、4:基因型GG；2:基因型AA；5:基因型AA；P：PCR 產(chǎn)物。

2.3基因型與等位基因頻率 由表1可見，rs7700944位點基因型頻率及等位基因頻率在寧夏回族人群RA組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=29.051、14.106，P<0.01)。等位基因A在對照組中的頻率高于RA組，OR(95%CI)為0.549(0.400～0.752)，而等位基因G在對照組中的頻率低于RA組，OR(95%CI)為1.823 (1.330～2.498)(P<0.01)。

3 討 論

以往研究表明，Tim基因多態(tài)性與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，因此，可根據(jù)其基因型預(yù)測個體對自身免疫性疾病的易感性[7-9]。Chae等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Tim-1基因在啟動子區(qū)和編碼區(qū)共有10個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)的變異與韓國人群哮喘的發(fā)生顯著相關(guān)。Khademi等[11]發(fā)現(xiàn)，由Th1和Th2細胞介導(dǎo)的疾病與Tim蛋白的參與具有一定關(guān)聯(lián)性。王長青等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3基因啟動子區(qū)2574 G>T的變異可能與山西漢族人群變應(yīng)性鼻炎易感性有關(guān)。張才成等[13]研究了Tim-3基因啟動子區(qū)-1541和-574、4259位點的變異，發(fā)現(xiàn)4259 T>G與湖北漢族人RA易感性有關(guān)。有研究表明，Tim-3基因-1541 C>T、4259 G>T的變異及Tim-1基因-232 A>G、-1637 A>G的變異與寧夏回族RA的發(fā)生有關(guān)[14-15]。

本研究首次對寧夏回族人群Tim-4基因多態(tài)性與RA發(fā)生的關(guān)聯(lián)性進行了研究。結(jié)果表明，rs7700944位點基因型頻率及等位基因頻率在寧夏回族人群RA組與對照組間，均存在極顯著的差異。等位基因G為寧夏回族人群易患RA的風(fēng)險因子，而等位基因A為保護因子。

rs7700944位點是位于Tim-4基因內(nèi)含子5中G>A的突變，該突變是否通過影響Tim-4基因的表達，從而對免疫相關(guān)疾病產(chǎn)生間接影響，尚需進一步研究證實。

本研究結(jié)果對寧夏回族RA的早期預(yù)防提供了參考數(shù)據(jù)，并可為今后進一步開展該基因與其他疾病的相關(guān)性奠定了基礎(chǔ)。

[1]郭文正．實用類風(fēng)濕關(guān)節(jié)病學(xué)[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2000:18.

[2]孟濟明，鄒和建．結(jié)締組織病新進展[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:308-309.

[3]McIntire JJ，Umetsu SE，Akbari O.Identification of Tapr(an airway hyperreactivity regulatory locus) and the linked Tim gene family[J].Nat Immunol,2001,2(12):1109-1116.

[4]Zhu C,Anderson AC,SchubartA,et al.The Tim-3 ligand galectin9 negatively regulates T helper type 1 immunity[J].Nat Immunol,2005,6(12):1245-1252.

[5]KuehnEW,ParkKM,SmomlS,etal.Kidneyinjurymolecule-1expressioninmurinepolycystickidneydisease[J].AmJPhysiolRenalPhysiol,2002,283(6):

F1326-1336.

[6]郭辰虹，王玉炯，舒暢，等.寧夏地區(qū)回族和漢族人群4個STR位點的遺傳多態(tài)性分析[J].山東大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2005，43(3)：192-194.

[7]Mcintire JJ,Umetsu SE,Macauba SC,et al.Immunology:hepatitis A virus link to atopic disease[J].Nature,2003,425(6895):576.

[8]Chae SC,Park YR,Shim SC,et al.The polymorphisms of Th1 cell surface gene Tim-3 are associated in a Korean population with rheumatoid arthritis[J].Immunol Lett,2004,95(1):91-95.

[9]Chae SC,Park YR,Song JH,et al.The polymorphisms of Tim-1 promoter region are associated with rheumatoid arthritis in a Korean population[J].Immunogenetics,2005,56(10):696-701.

[10]Chae SC,Song JH,Heo JC,et al.Molecular variations in the promoter and coding regions of human tim1 gene and their association in Koreans with asthma[J].Hum Immunol,2003,64(12):1177-1182.

[11]Khademi M,Illes Z,Gielen AW,et al.T cell Ig-and mucin-domain-containing molecule-3(TIM-3) and TIM-1 molecules are differentially expressed on human Th1 and Th2 cells and in cerebrospinal fluid-derivedmononuclear cells in multiple sclerosis[J].J Immunol,2004,172(11):7169-7176.

[12]王長青，彭詩東.Tim-3基因的多態(tài)性與變應(yīng)性鼻炎的相關(guān)性[J].山西醫(yī)藥雜志,2008,37(8):688-690.

[13]張才成，吳健民，崔天盆，等.Tim-3啟動子區(qū)基因多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎之間關(guān)系的研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2005，9(9)：526-529.

[14]Xu JR,Yang Y,Liu XM,et al.Polymorphisms of the TIM-1 gene are associat ed with rheumatoid arthritis in the Chinese Hui minority ethnic population[J].Genet Mol Res,2012,11(1):61-69.

[15]Xu JR,Yang Y,Liu XM,et al.The -1541 C>T and +4259 G>T of TIM-3 polymorphisms are associated with rheumatoid arthritis susceptibility in a Chinese Hui population[J].Int J Immunogenet,2011,38(6):513-518.