王瑞君

(宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,江西宜春 336000）

枸杞對乳酸桿菌體外保存活力及體內(nèi)定植的影響

王瑞君

(宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,江西宜春 336000）

研究了枸杞對乳酸桿菌保存和體內(nèi)定植的影響。采用MRS液體培養(yǎng)基中添加不同濃度的枸杞水解產(chǎn)物，觀察一個月內(nèi)常溫下培養(yǎng)基中乳酸桿菌活菌數(shù)的變化。實(shí)驗(yàn)小鼠用抗生素脫污染，導(dǎo)致菌群失調(diào)后，分別用單一乳酸桿菌治療、乳酸桿菌與枸杞聯(lián)合治療5 d后，統(tǒng)計(jì)不同治療組中指示菌的變化，確定枸杞對乳酸桿菌在體內(nèi)定植的影響。結(jié)果表明，添加不同體積分?jǐn)?shù)的枸杞水解產(chǎn)物后，MRS液體培養(yǎng)基中乳酸桿菌的存活數(shù)高于對照組；實(shí)驗(yàn)小鼠用不同方式治療后，聯(lián)合治療組乳酸桿菌的數(shù)量高于單一乳酸桿菌治療組。枸杞對乳酸桿菌的保存及體內(nèi)定植具有促進(jìn)作用。

枸杞；乳酸桿菌；保存活力；定植

0 引言

研究表明乳酸菌等益生菌有助于降低宿主體內(nèi)膽固醇水平[1]、改善宿主的免疫功能[2]。許多研究證實(shí)益生菌對腹瀉、過敏、腸易激綜合征、炎癥性腸病等有療效[3,4]。但益生菌通過胃腸道定植時易受胃酸、膽汁等因素的影響而使其活菌數(shù)急劇下降，不利于益生菌發(fā)揮益生作用。益生菌產(chǎn)品在存放、運(yùn)輸?shù)冗^程中易受溫度等環(huán)境條件的影響而使活菌數(shù)不穩(wěn)定。本文研究枸杞對乳酸桿菌的保存定植是否有促進(jìn)作用，以期克服益生菌在應(yīng)用時存在的問題。

枸杞（Lycium chinenseMill.）富含枸杞多糖、甜菜堿、類胡蘿卜素、抗壞血酸、莨菪亭、氨基酸及礦質(zhì)元素等多種成分[5-6]，具有抗氧化、提高免疫力等多種功效[7-9]。對于枸杞的化學(xué)成分、藥理、保健功能等研究較多，但有關(guān)枸杞等中草藥對益生菌的保存、定植等促進(jìn)作用研究未見報道。通過本文的研究可為微生態(tài)制劑的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

枸杞，嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus）。

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基用于乳酸桿菌的活化、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。EMB培養(yǎng)基用于大腸桿菌的培養(yǎng)與計(jì)數(shù)。

氨芐青霉素（用無菌水配制質(zhì)量濃度為0.5 g/L的氨芐青霉素溶液）。KM小鼠15只，體質(zhì)量（18±2）g，飼養(yǎng)于潔凈動物房內(nèi)。

1.2 方法

（1）枸杞水解產(chǎn)物的制備。枸杞粉碎，稱取50 g，加水500 mL浸泡30 min后煎煮，沸騰后文火煮30 min，過濾，收集濾液，濾渣用同樣的方法煎煮2次，過濾，收集濾液。3次濾液混合后，濃縮至生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL，3 000 r/min離心10 min，取上清，115℃高壓滅菌30 min后置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）枸杞水解產(chǎn)物對乳酸桿菌保存活力的影響。將活化的嗜酸乳桿菌以1%的接種量分別接種于含枸杞水解產(chǎn)物0%，2.5%，5%，10%，20%（體積分?jǐn)?shù)）的MRS液體培養(yǎng)基中。37℃，厭氧培養(yǎng)48 h,取樣1 mL用MRS固體培養(yǎng)基計(jì)數(shù)（此時的活菌數(shù)定義為0 d的活菌數(shù)）。剩余培養(yǎng)液放置室溫下，每隔10 d取1 mL培養(yǎng)液用MRS固體培養(yǎng)基計(jì)數(shù)。比較30 d內(nèi)乳酸桿菌的存活數(shù)。

（3）小鼠脫污染模型的制備。小鼠靜養(yǎng)2 d后，無菌條件下，取其糞便稱重，用生理鹽水稀釋后，檢測大腸桿菌與乳酸桿菌。小鼠靜養(yǎng)2 d后，自由飲用質(zhì)量濃度為0.5 g/L的氨芐青霉素溶液，連續(xù)飲用5 d后，取小鼠糞便檢測大腸桿菌與乳酸桿菌。

（4）實(shí)驗(yàn)小鼠的分組與處理：小鼠脫污染模型制備成功后，15只小鼠隨機(jī)分為3組，5只為自然恢復(fù)組，每天自由飲用無菌水與自由取食鼠糧。5只為乳酸菌治療組，小鼠在自由飲用無菌水與自由取食鼠糧的基礎(chǔ)上，每天灌胃菌數(shù)為108mL-1的乳酸桿菌0.5 mL，每天1次，連續(xù)灌胃5 d。5只為枸杞與乳酸桿菌共同治療組，在每只小鼠每天灌胃乳酸桿菌的基礎(chǔ)上在小鼠的食物中添加枸杞子，添加量為10 g/(d·只)，連續(xù)5 d。5 d后分別取三組小鼠的糞便檢測大腸桿菌與乳酸桿菌的數(shù)量。

（5）小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的檢測指標(biāo)。檢測大腸桿菌、乳酸桿菌的變化。無菌取小鼠糞便，稱重，用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇合適濃度在相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

1.9數(shù)據(jù)分析：細(xì)菌的菌落數(shù)轉(zhuǎn)換為對數(shù)值。采用spss15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用student-t檢驗(yàn)，差異顯著性水平設(shè)為P=0.05。

2 結(jié)果

2.1 枸杞對乳酸桿菌保存活力的影響

圖1為枸杞對乳酸桿菌保存活力的影響。由如圖1可以看出，37℃,厭氧條件下培養(yǎng)2 d,空白對照組為5.8×107mL-1，但隨著MRS培養(yǎng)基中添加枸杞水解產(chǎn)物濃度的增加，在同樣培養(yǎng)時間內(nèi)，乳酸桿菌的數(shù)量呈上升趨勢。這一結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，枸杞水解產(chǎn)物對乳酸桿菌的生長有促進(jìn)作用。

圖1數(shù)據(jù)顯示，枸杞水解產(chǎn)物在一定濃度范圍內(nèi)，對乳酸桿菌的保存活力具有促進(jìn)作用：室溫下放置10，20，30 d后，空白對照組乳酸桿菌的存活率（第N天的菌落數(shù)/第0天的菌落數(shù)×100%）較低，活菌數(shù)下降較快，而隨著培養(yǎng)基中枸杞水解產(chǎn)物濃度的增加，乳桿菌的存活率顯著高于對照組，乳酸桿菌的活菌數(shù)下降速度減慢。

2.2 枸杞對乳酸桿菌體內(nèi)定植的影響

結(jié)果如表1所示?？股靥幚? d后，乳酸桿菌、大腸桿菌的數(shù)量與正常組相比，具有極顯著差異（P﹤0.01）,小鼠自然恢復(fù)5 d后,體內(nèi)大腸桿菌、乳酸桿菌仍未恢復(fù)到正常水平（P﹤0.05）。灌胃乳酸桿菌5 d后，乳酸桿菌恢復(fù)到正常水平，但大腸桿菌的數(shù)量高于正常組（P﹤0.05）。乳酸桿菌與枸杞聯(lián)合治療5 d后，乳酸桿菌與大腸桿菌恢復(fù)到正常水平。在兩種處理方式中，乳酸桿菌組中乳酸桿菌的數(shù)量低于聯(lián)合治療組（P﹤0.05），大腸桿菌的數(shù)量高于聯(lián)合治療組。這一結(jié)果表明，枸杞有利于乳酸桿菌在體內(nèi)的定植以及腸道菌群恢復(fù)正常。

表1 枸杞對乳酸桿菌體內(nèi)定植的影響

3 討論

圖1結(jié)果表明，枸杞對乳酸桿菌的生長、保存有促進(jìn)作用。這一結(jié)果的出現(xiàn)可能與枸杞含有多種化學(xué)成分有關(guān)。枸杞中含有豐富的枸杞多糖，資料證實(shí)，乳酸桿菌可發(fā)酵利用葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等多種成分[10]。枸杞多糖可能在乳酸桿菌產(chǎn)生的某些胞外水解酶的作用下分解為阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等多種單糖,為乳酸桿菌的生長、繁殖提供能量。乳酸桿菌為厭氧或微需氧微生物，枸杞中的甜菜堿、綠原酸、抗壞血酸等具有抗氧化作用[11]，可能為乳酸桿菌的存活、定植提供了有利環(huán)境。Bae[12]等曾報道枸杞的醇提取物提高了酸奶的抗氧化活性。

嗜酸乳桿菌是人體和其他動物的益生菌，在酸乳等制品中應(yīng)用廣泛，可在動物體內(nèi)定植。表1數(shù)據(jù)顯示，灌胃嗜酸乳桿菌后提高了體內(nèi)乳酸桿菌的數(shù)目，但大腸桿菌高于正常水平。同時服用枸杞與乳酸桿菌后，枸杞對乳酸桿菌的定植與恢復(fù)具有促進(jìn)作用，且大腸桿菌恢復(fù)到正常水平。這一結(jié)果表明枸杞對胃腸道微生態(tài)平衡具有調(diào)節(jié)作用。枸杞中營養(yǎng)成分豐富,可能含有促進(jìn)乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益微生物生長的生長因子等，促進(jìn)其生長，使其成為腸道中的優(yōu)勢菌群，增強(qiáng)對大腸桿菌等條件致病菌的拮抗作用。但枸杞成分復(fù)雜，各成分對乳酸桿菌的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。

[1]CHEN Y L,WU L Y,LEE T C,et al.Cholesterol-lowering Effect of Phytosterol-containing Lactic-fermented Milk Owder in Hamsters[J]. Food Chemistry,2010,119:1121-1126.

[2]WU R,WANG L,WANG J,et al.Isolation and Preliminary Probiotic Selection ofLactobacilli from Koumiss in Inner Mongolia[J]. Journal of Basic Microbiology,2009,49(3):1-9.

[3]GILLILAND S E.Health and Nutritional Benefits from Lactic Acid Bacteria[J].FEMS Microbiol Rev.,1990,7:175-188.

[4]RASTALL R A,GIBSON G R,GILL H S,et al.Modulation of the Microbial Ecology of the Human Colon by Probiotics,Prebiotics and Symbiotic to Enhance Human Health:an Overview of Enabling Science and Potential Applications[J].FEMS Microbiol.Ecol.,2005,52: 145-152.

[5]謝忱,徐麗珍,李憲銘,等.枸杞子化學(xué)成分的研究[J].中國中藥雜志, 2001,26(5):323-324.

[6]劉萍,王風(fēng)英.不同產(chǎn)地枸杞子微量元素的對應(yīng)分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(19):8135-8136,8155.

[7]楊薛康,海春旭,梁欣,等.枸杞提取物的抗氧化作用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2007,28(6):518-520.

[8]沈自尹,郭為民,陳瑜.枸杞多糖調(diào)控老年大鼠T細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的研究[J].中國免疫學(xué)雜志,2002,18:628-630.

[9]徐曼妮,張欣文,徐思紅,等.枸杞膠囊對果蠅的延緩衰老作用[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報·醫(yī)學(xué)版,2001,22(4):6-7.

[10]東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社. 2001：289-294.

[11]HAN S H,LEE H H,LEE I S,et al.A New Phenolic Amide from Lycium Chnense Miller[J].Archives of Pharmacal Research,2002,25 (4):433–437.

[12]BAE H C,CHO I S,NAM M S.Effects of the Biological Function of Yogurt Added with Lycium Chinence Miller Extract[J].J.Korean Soc.Journal of Animal Science and Technology,2005,47(6):1051-1058.

Effects of Chinese wolfberry(Lycium chinense Mill.）on the preservation and colonization of Lactobacillus

WANG Rui-jun
（Yichun University.College of Chemistry and Bioengineering,Yichun 336000，China）

To study the effects of Chinese wolfberry on the preservation and colonization ofLactobacillus.Preservation effect of Chinese wolfberry onLactobacilluscells were observed when MRS broth was supplemented with different concentration hydrolysate of Chinese wolfberry. Mice

orally antibiotics in the drinking water ad lib to induce microflora dysbiosis.On the sixth day,the mice cured byLactobacillusorLactobacilluscombinedLycium chinense.After five days,indicator bacteria were counted to determine the effectLycium chinenseon colonization ofLactobacillus.Cell grown on MRS containing hydrolysate of Chinese wolfberry showed a cell concentration is significantly higher than control group.Results demonstrated that the number ofLactobacilluswas significantly higher in the feces of the mice fedLactobacillusand Chinese wolfberry.Chinese wolfberry can promote the preservation and colonization ofLactobacillus.

Lycium chinenseMill;Lactobacillus;Preservation;Colonization

Q93-335

A

1001-2230（2012）03-0022-02

2011-10-19

由江西省教育廳(JXJG-10-14-13)，江西宜春科技局（JXYC 2010KNB003）資助。

王瑞君（1970-），女，講師，主要從事微生物方面的研究。