祝愛珍 劉成成 陳小宇 李 軍 何冬梅 劉革修 (暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東 廣州 510632)

關(guān)于細(xì)胞衰老的原因有多種學(xué)說，包括基因組和線粒體基因組完整性的喪失、基因表達(dá)失衡、遺傳因素、DNA損傷、氧化損傷、端粒末端的縮短等〔1〕。細(xì)胞的衰老是不可抗拒的，但是可調(diào)控的〔2〕。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)作為多能干細(xì)胞，不僅具有極強(qiáng)的分化能力，而且具有產(chǎn)生多種生物活性因子、調(diào)節(jié)組織特異細(xì)胞活性的作用。在體外常用來做飼養(yǎng)層細(xì)胞擴(kuò)增胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等，在體內(nèi)起著穩(wěn)定組織內(nèi)環(huán)境的作用。隨年齡的增長(zhǎng)機(jī)體MSCs的質(zhì)量和含量不斷下降，對(duì)組織特異細(xì)胞的支持調(diào)節(jié)作用下降，導(dǎo)致組織特異細(xì)胞衰老的加速。用更原始的細(xì)胞不斷補(bǔ)充替代衰老的細(xì)胞或者發(fā)揮其相應(yīng)功能是否能起到抗衰老作用?本實(shí)驗(yàn)設(shè)想通過不斷輸注外源性MSCs改善心血管系統(tǒng)衰老進(jìn)程，為臨床心血管抗衰老研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司的小鼠SRY DNA生物素標(biāo)記POD和熒光FISH原位雜交雙染色系統(tǒng)(Y染色體原位雜交試劑盒)，美國GIBCO公司的DMEMF12液體培養(yǎng)基，奧地利PAA公司胎牛血清，加拿大Visual Sonics公司Vevo770?高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)，地塞米松、胰島素、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤、抗壞血酸、β-磷酸甘油、茜素紅購自Sigma。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，合格證號(hào)SCXK(川)2004-15，15月齡，將小鼠隨機(jī)分為2組，分別作為對(duì)照組、移植組，對(duì)照組20只小鼠，移植組20只小鼠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 胎鼠MSCs的提取 斷髓處死妊娠13.5 d的孕鼠，無菌取出胎鼠，去除胎鼠頭、尾、四肢及內(nèi)臟，PBS洗滌數(shù)次，剪成約1 mm3大小組織塊，0.2%膠原酶Ⅳ于37℃消化60 min，混懸液過200目篩網(wǎng)，收集濾過液，PBS稀釋，離心，細(xì)胞沉淀再用PBS漂洗2次，懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以1×106/cm2密度接種于含10%胎牛血清的DMEM-F12完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 h后全量換液，棄非貼壁細(xì)胞。待細(xì)胞融合達(dá)80%，用0.25%胰酶消化，按1∶3進(jìn)行傳代。

1.3.2 胎鼠MSCs的鑒定 收集適量P3代細(xì)胞做鑒定。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44、CD29、CD45等表面標(biāo)志。成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)鑒定：以含5%胎牛血清的DMEM-F12加1 mol/L地塞米松、5 U/ml胰島素、200 μmol/L吲哚美辛、0.5%異丁基甲基黃嘌呤配制成脂肪誘導(dǎo)分化液，待觀察到胞漿中有脂滴形成時(shí)，油紅O染色鑒定。成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)鑒定：以含5%胎牛血清的 DMEM-F12 加 10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml抗壞血酸，誘導(dǎo)28 d后茜素紅染色鑒定。

1.3.3 移植胎鼠MSCs 移植組每只小鼠每次尾靜脈注射0.2 ml約107個(gè)P3代MSCs細(xì)胞，每月注射一次，連續(xù)注射3次;對(duì)照組每月注射一次等量PBS溶液，連續(xù)注射3次。

1.3.4 小鼠衰老狀態(tài)的觀察 首先總體觀察比較移植前后對(duì)照組和移植組小鼠的形態(tài)改變、精神狀況以及活動(dòng)度。從對(duì)照組和移植組中各隨機(jī)選取10只小鼠于MSCs移植前以及移植3個(gè)月后，用Vevo770?高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)對(duì)其做心臟檢查。其中超聲測(cè)量指標(biāo)為左室質(zhì)量、心輸出量、每搏量、左室舒張期容積。處死小鼠，在心臟同一部位取材，石蠟切片心臟組織學(xué)檢查，評(píng)價(jià)組織衰老程度通過0～4分法雙盲打分〔3〕，按Y染色體原位雜交試劑盒說明書操作檢測(cè)石蠟切片中植入的干細(xì)胞是否有表達(dá)分化為心肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MSCs鑒定結(jié)果 原代胎鼠細(xì)胞呈梭形貼壁生長(zhǎng)，有較多的集落形成，生長(zhǎng)速度快，平均16 h傳代一次，第三代細(xì)胞形態(tài)比較均勻，集落較少。P3代細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志CD44、CD29陽性率達(dá)98%，CD45陰性率達(dá)95%。P3代細(xì)胞做成脂、成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證明移植的細(xì)胞為MSCs。成脂油紅O染色結(jié)果，可見胞漿中有大量被染成鮮紅色的小脂滴。成骨茜素紅染色結(jié)果，細(xì)胞質(zhì)被染成紅色的鈣結(jié)節(jié)隨處可見。見圖1。

2.2 移植后小鼠總體改變 移植后未發(fā)現(xiàn)MSCs移植對(duì)小鼠造成明顯不良影響，并且觀察到移植組小鼠的體力活動(dòng)、精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度優(yōu)于對(duì)照組。移植前以及移植3個(gè)月后兩組小鼠體重均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 植入細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸 移植3個(gè)月后的小鼠Y染色體原位雜交未在心臟組織中檢測(cè)到植入的MSCs。

2.4 超聲心動(dòng)圖情況 對(duì)照組和移植組在實(shí)驗(yàn)3個(gè)月后相對(duì)于實(shí)驗(yàn)前的心臟超聲測(cè)量各指標(biāo)的改變量都存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖2，表1。

2.5 組織學(xué)檢查結(jié)果 移植3個(gè)月后，對(duì)照組與移植組心臟組織學(xué)衰老程度相比，對(duì)照組心臟心肌病樣改變明顯，心肌間質(zhì)廣泛纖維化，心肌脂肪變性，細(xì)胞質(zhì)玻璃樣變，細(xì)胞質(zhì)空泡形成;肌纖維大小不一，肌小節(jié)斷裂，異位鈣化，小動(dòng)脈硬化，充血性心力衰竭樣改變明顯。見圖3。

表1 兩組小鼠左心室重量、心輸出量、組織衰老程度評(píng)分、左心室舒張末期容量等指標(biāo)的比較(± s，n=10)

表1 兩組小鼠左心室重量、心輸出量、組織衰老程度評(píng)分、左心室舒張末期容量等指標(biāo)的比較(± s，n=10)

與對(duì)照組比較：1)P＜0.05

組別 左室重量(mg) 心輸出量(ml/min) 梗死體積(μl) 左室舒張末容量(μl) 心臟指數(shù)(%) 心肌病理嚴(yán)重程度(score)對(duì)照組 19.34±9.73 12.95±2.76 12.76±7.25 9.46±4.050.55±0.05 1.60±1.13移植組 11.34±6.721) 7.50±2.651) 6.89±4.901) 5.50±2.321) 0.49±0.081) 2.60±0.911)

圖1 MSCs鑒定結(jié)果

圖2 兩組超聲心動(dòng)圖左室舒張期容積

圖3 移植后對(duì)照組和移植組小鼠心臟組織學(xué)對(duì)比(×20)

3 討論

胎鼠MSCs具有多向分化潛能，屬于多能造血干細(xì)胞，因?yàn)槿菀左w外培養(yǎng)、高度擴(kuò)增能力，多分化潛能、免疫原性低等優(yōu)勢(shì)，被廣泛運(yùn)用于細(xì)胞替代治療和細(xì)胞支持治療，大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明其巨大的運(yùn)用前景〔4，5〕。我們上述實(shí)驗(yàn)已通過表面CD分子的流式細(xì)胞儀測(cè)定、成脂油紅O染色和成骨茜素紅染色實(shí)驗(yàn)鑒定了我們的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為 MSCs。從理論上講，MSCs可以無限增殖、生長(zhǎng)，但 Wagner等〔6〕報(bào)道人 MSCs培養(yǎng)7～12代出現(xiàn)衰老，大鼠骨髓MSCs培養(yǎng)到10代以后也開始有衰老現(xiàn)象，其增殖能力和成骨分化能力隨著年齡的增加而降低。本實(shí)驗(yàn)表明移植胎鼠MSCs能有效地延緩小鼠心血管系統(tǒng)自然衰老進(jìn)程。15月齡的小鼠(小鼠平均壽命為19個(gè)月)的心血管系統(tǒng)存在著一系列的老年性小鼠心血管系統(tǒng)衰老變化：心肌細(xì)胞纖維化，脂褐素沉積，膠原增多，淀粉樣變;心臟瓣膜退行性變和鈣化;心肌的興奮性、自律性、傳導(dǎo)性均降低;動(dòng)脈硬化，彈性纖維和膠原纖維失衡，彈性作用明顯減弱;心肌收縮力減弱、心輸出量減少，總外周阻力增加，組織毛細(xì)血管密度降低等。而超聲心動(dòng)圖顯示移植組左室舒張期容積、每搏輸出量、心肌收縮力均明顯高于對(duì)照組，移植組小鼠心臟組織學(xué)更是呈現(xiàn)相對(duì)年輕化改變，對(duì)照組小鼠心肌間質(zhì)纖維化，心肌脂肪變性，細(xì)胞質(zhì)玻璃樣變，細(xì)胞質(zhì)空泡形成程度都更明顯更嚴(yán)重。

然而，移植3個(gè)月后的小鼠心肌組織切片Y染色體原位雜交結(jié)果表明，在心臟組織中僅檢測(cè)到數(shù)個(gè)植入的胎鼠MSCs源性的心肌細(xì)胞。這與組織選擇性差，MSCs被分散到血流經(jīng)過的任何部位，最主要是與肺組織的截留有關(guān)。但很明顯移植MSCs的抗小鼠衰老作用與細(xì)胞替代作用關(guān)系不大。在生理狀態(tài)下，MSCs在組織細(xì)胞中起著重要的支持調(diào)節(jié)作用，如造血系統(tǒng)衰老的重要原因是MSCs的衰老，向脂肪細(xì)胞分化增加，分泌重要細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的能力下降，造血微環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)控能力的下降，甚至抑制造血使之不能滿足機(jī)體需要〔7〕。因此補(bǔ)充MSCs低氧條件培養(yǎng)液以補(bǔ)充各種細(xì)胞因子對(duì)小鼠造血系統(tǒng)的自然衰老有抑制作用〔8〕。同樣，本實(shí)驗(yàn)中MSCs影響小鼠心血管系統(tǒng)自然衰老進(jìn)程的機(jī)制考慮可能與MSCs分泌多種細(xì)胞因子改變心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的微環(huán)境有關(guān)，如有文獻(xiàn)報(bào)道心肌梗死后輸注MSCs條件培養(yǎng)液可以減少心肌損傷〔9〕，心肌梗死后MSCs通過旁分泌多種細(xì)胞因子和復(fù)雜的信號(hào)通路發(fā)揮作用〔10〕。

雖然有文獻(xiàn)報(bào)道移植MSCs不能改善心肌梗死后的心律失常和代謝紊亂〔11〕。但是綜上所述本實(shí)驗(yàn)得出較明顯結(jié)論：移植胎鼠MSCs有明顯的抗小鼠心血管衰老作用，且與MSCs分泌的多種細(xì)胞因子有關(guān)。另外，MSCs的衰老與腫瘤、慢性心衰、肌萎縮、肺纖維化、骨關(guān)節(jié)等疾病以及機(jī)體、組織器官的衰老密切相關(guān)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)〔12～14〕證明：補(bǔ)充臍帶MSCs能有效的抑制小鼠自然衰老進(jìn)程，如抑制骨髓的脂肪化的進(jìn)程，造血系統(tǒng)衰老的進(jìn)程等，這為老年股骨頭壞死、骨質(zhì)疏松癥等骨髓過度脂肪化疾病以及老年性的各種體質(zhì)衰落、老年性疾病治療提供了新的思路。而本實(shí)驗(yàn)移植對(duì)于小鼠無免疫性的胎鼠MSCs，也能起到抗小鼠心血管自然衰老的作用。從MSCs衰老的多種原因出發(fā)或者不斷補(bǔ)充外源性MSCs以維持MSCs自身平衡，從而起到抗細(xì)胞衰老作用，對(duì)這一系列老年性疾病的治療和改善中老年人的生活質(zhì)量有著重要意義。

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