畢鵬翔，張忠敏，周小莉，郭艷芹

(1．牡丹江醫(yī)學(xué)院 附屬紅旗醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157011;2．寧夏醫(yī)科大學(xué) 附屬心腦血管醫(yī)院，寧夏 銀川 750004)

水飛薊賓對阿爾茨海默病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及對神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響

畢鵬翔1，張忠敏1，周小莉2，郭艷芹1

(1．牡丹江醫(yī)學(xué)院 附屬紅旗醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157011;2．寧夏醫(yī)科大學(xué) 附屬心腦血管醫(yī)院，寧夏 銀川 750004)

目的 探討水飛薊賓對阿爾茨海默病(AD)大鼠行為的改善作用及對神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)自由基的清除情況。方法 大鼠60只，采用皮下注射東莨菪堿致AD模型，隨機(jī)分為模型組、空白對照組、水飛薊賓高中低劑量組及陽性對照多奈哌齊組，用Morris水迷宮法，檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。另外采用過氧化試劑誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)過氧化損傷通過流式細(xì)胞儀檢測水飛薊賓對活性氧自由基的清除能力。結(jié)果 模型組與空白對照組比學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，治療組與模型組比學(xué)習(xí)記憶能力得到顯著改善，同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)水飛薊賓能顯著降低細(xì)胞內(nèi)的自由基水平。結(jié)論 水飛薊賓對AD有較好的改善作用，其機(jī)制可能與其抗自由基活性有關(guān)。

水飛薊賓;阿爾茨海默病;水迷宮;自由基

隨著社會的發(fā)展，人口老齡化的加劇，阿爾茨海默病(Alzheimer'Disease，AD)的患病率和發(fā)病率呈指數(shù)上升。AD是一種神經(jīng)退行性疾?。?］，神經(jīng)元進(jìn)行性的退化，喪失功能并死亡，被AD破壞的大腦隨著疾病破壞神經(jīng)組織，其體積和重量都會縮小。其顯著特征是嚴(yán)重的記憶喪失和個(gè)性改變，患者生活不能自理，壽命明顯縮短［2］。本研究通過水飛薊賓對 AD大鼠模型的干預(yù)，及對神經(jīng)細(xì)胞(SHSY5Y)的作用，探討水飛薊賓對 AD大鼠及 SHSY5Y 內(nèi)自由基的影響［3］。

1 材料

SH-SY5Y細(xì)胞，American Type Culture Collection，ATCC，Rockville，MD，USA。

東莨菪堿，成都瑞芬思生物科技有限公司;水飛薊賓，天津天士力制藥股份有限公司;多奈哌齊，天津力生制藥股份有限公司。

胎牛血清，杭州四季青公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)，Sigma公司;RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibco公司。

MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱，三洋公司;KQ-500DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器公司;IX70-142倒置式生物顯微鏡，日本奧林巴斯;Morris水迷宮分析系統(tǒng)，上海欣欣信息科技有限公司;流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

健康雄性Wistar大鼠60只，體重(200±20)g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號:SCXK(黑)2006-010。

2 方法

2．1 動物分組及給藥

隨機(jī)分為6組，每組10只?？瞻讓φ战M皮下注射生理鹽水;模型組皮下注射東莨菪堿0．4 mg/kg;水飛薊賓高中低劑量組(100，200，400 mg/kg)口服給藥2 h后給予東莨菪堿［4］;陽性對照組皮下注射多奈哌齊1．2 mg/kg，30 min后給予東莨菪堿。各組動物30 min后進(jìn)行Morris水迷宮檢測。

2．2 AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能測定

應(yīng)用Morris水迷宮法［5］。實(shí)驗(yàn)于造模前訓(xùn)練2 d，動物每天4次下水訓(xùn)練、造模后給藥后連續(xù)3 d實(shí)驗(yàn)動物同樣每天下水4次，每次分別從池壁4個(gè)不同起始點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水池，記錄每次找到平臺的時(shí)間即為逃避潛伏期，記錄動物的潛伏期。第5天實(shí)驗(yàn)撤掉站臺檢測動物穿越站臺區(qū)域的次數(shù)［6］。

2．3 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

SH-SY5Y細(xì)胞接種在含5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分為空白組;模型組給予過氧化叔丁基醇(tBHP)500 μmol;水飛薊賓組在給予tBHP 1 h后給予水飛薊賓 15 μmol，12 h 后 DCFH-DA(2，7，-dihydro-dichloro fluorescein diacetate)染色30 min，形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞儀檢測活性氧(ROS)的水平［7］。

3 結(jié)果

3．1 大鼠行為能力

各組大鼠在Morris水迷宮中定向航行試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M與空白組相比動物的潛伏期顯著增加，模型組的大鼠喪失學(xué)習(xí)記憶能力，平均逃避潛伏期改變不大。而給予水飛薊賓的AD大鼠，平均逃避潛伏期時(shí)間明顯縮短(P＜0．05)。說明經(jīng)過水飛薊賓治療的AD大鼠，空間記憶學(xué)習(xí)能力明顯提高，見表1。

3．2 空間探索試驗(yàn)

拆去水下平臺后，以原站臺位置(第3象限)的動物穿梭次數(shù)為指標(biāo)，模型組在第3象限穿越站臺次數(shù)明顯降低，而給予高劑量水飛薊賓治療的AD大鼠則顯著增加，與陽性對照組相當(dāng)。見表1。

3．3 流式細(xì)胞術(shù)檢測SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生ROS

tBHP可以誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，水飛薊賓組ROS的產(chǎn)生量顯著降低。見圖1。模型組的ROS陽性細(xì)胞為(19．83±1．68)%，明顯高于對照組的(3．03 ±0．32)%(P ＜0．01);水飛薊賓組為(7．77 ±0．40)%，明顯低于模型組(P ＜0．01)。

表1 大鼠在Morris水迷宮中逃避潛伏期穿越站臺次數(shù)(n=10，x±s)

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測儀檢測ROS的結(jié)果

4 討論

本研究顯示，造模后模型組大鼠認(rèn)知能力較空白對照組明顯下降;治療后，各給藥組與模型組比較認(rèn)知能力明顯改善，表明水飛薊賓可改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

SH-SY5Y源于SH-N-SH的神經(jīng)瘤型亞系，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制和防止措施的研究中。自由基代謝異常是AD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)理之一。

ROS誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷參與了一系列的神經(jīng)病理學(xué)過程，包括腦缺血，神經(jīng)退行性疾病等。水飛薊賓能通過消除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化及5-脂氧酶活性來降低被損傷腦組織中丙二醛及白三烯含量，升高超氧化歧化酶含量。本實(shí)驗(yàn)給予藥物干預(yù)后ROS水平明顯下降。

本研究提示，黃酮類化合物水飛薊賓對AD大鼠的腦神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，可能是通過清除細(xì)胞內(nèi)過多的自由基，降低細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的，從而改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，對AD的防治和改善具有現(xiàn)實(shí)意義，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］ Sunderland T，Tariot P N，Newhouse，P A．Differential responsively of mood，behavior，and cognition to cholinergic agents in elderly neuropsychiatric populations［J］．Brain Res，1988，472:371-389．

［2］ Zemski A J，Quinlivan R M，Gibala，et al．A-Z of nutritional supplements:dietary supplements，sports nutrition foods and ergogenic aids for health and performance:Part 36［J］．Br J Sports Med，2012，46:893-894．

［3］ Barnhart K T，Gosman G，Ashby R，et al．The medical management of ectopic pregnancy:a meta-analysis comparing"single dose"and"multidose"regimens［J］．Obstet Gynecol，2003，101:778-784．

［4］ 葉翠飛，張 蘭，張 麗，等．?；撬釋|莨菪堿所致記憶獲得性障礙模型小鼠的改善作用［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2005，21:715-718．

［5］ Bavaresco C S，Streck E L，Netto C A，et al．Chronic hyperprolinemia provokes a memory deficit in the Morris water maze task［J］．Metabolic Brain Disease，2005，20:73-80．

［6］ Gery S，Clay A，Susan F．Intermittent binge alcohol exposure during the preadolescent period induces spatial working memory deficits in young adult rats［J］．Alcohol，2008，42(6):459-467．

［7］ Hotz M A，Del B G，et al．Cytostatic and cytotoxic effects of fostriecin on human promyelocytic HL-60 and lymphocytic MOLT-4 leukemic cells［J］．Cancer Res，1992，52:1530-1535．

The impact of silibinin on learning and memory in rats with Alzheimer's and the reactive of oxygen in nerve cells

BI Peng-xiang1，ZHANG Zhong-min1，ZHOU Xiao-li2，GUO Yan-qin1
(1．Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China;2．The Cerebrovascular Hospital Affilated to Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China)

Purpose To investigate the protecting effects of silibinin on the behavior of Alzheimer's(AD)rats and on tert-Butylhydroperoxide(tBHP)-induced reactive oxygen species(ROS)in neuroblastoma cells(SH-SY5Y)．Methods 60 rats modeled with injection of scopolamine were randomly divided into model group，control group，silibinin(high-mid-low dose)groups，and the positive control group with donepezil treatment．The ability of learning and memory was appraised by water maze test．SH-SY5Y cells peroxidation damage was induced by peroxide reagent and eliminating effects of ROS were in valued by flow cytometry．Results Compared with control group，the learning and memory ability of scopolamine group was much declined，but it became much better in silibinin treatment group．Besides，experiments in vitro confirmed that silibinin could reduce the intracellular level of free radical significantly．Conclusion-Silibinin plays an important role in improvement of AD and the mechanism may attribute to with its antifree radical activity．

silibinin;Alzheimer's disease;water maze;ROS

R285．5

A

1005-1678(2012)06-0802-03

2012-08-02

國家自然科學(xué)基金(NO．81141080);黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NO．D2007-100)

畢鵬翔，男，講師，碩士;郭艷芹，女，通信作者，教授，Email:yanqinguo@sina．com。