袁志堅，周 紅，何曉升，何文涓

(1．無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術學校，江蘇 無錫 214028;2．杭州師范大學 臨床醫(yī)學院，浙江 杭州 310016)

脂肪來源干細胞在移植脂肪中的分化及其相關miRNA的表達

袁志堅1，周 紅1，何曉升2，何文涓1

(1．無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術學校，江蘇 無錫 214028;2．杭州師范大學 臨床醫(yī)學院，浙江 杭州 310016)

本文介紹脂肪來源干細胞(ADSCs)在移植脂肪中經信號通路傳遞信號來調控ADSCs分化中轉入因子的活性，及其分化中miRNA的表達，闡明ADSCs成脂分化中的作用機制，另外，從ADSCs成脂分化中脂肪細胞的形態(tài)變化觀察其組織學特點及對幾種檢測手段的簡單介紹。

脂肪來源干細胞;成脂分化;轉錄因子;信號通路;miRNA

脂肪來源干細胞(ADSCs)來源豐富，可進行自體移植，無免疫排斥反應之慮，其低免疫源性使其可行同種異體移植甚至異體異種移植，這更加拓寬了其應用范圍，而且取材簡便，有些是臨床治療后的副產品。ADSCs增殖能力非常強，據報道傳至第10代仍具較強向脂肪細胞定向分化的能力［1］。在整形外科中，ADSCs的移植可應用于如皺紋的填充，痤瘡瘢痕凹陷的填充，皮脂腺囊腫切除后局部皮下組織的缺損的填充，乳腺癌切除后乳腺的重建等［2］。脂向分化是一個包括激素刺激、信號轉導、基因表達改變和細胞形態(tài)學改變的復雜過程。多種轉錄因子形成的網絡狀的系統(tǒng)參與到整個脂向分化的過程中，miRNA是基因表達的一種重要的轉錄后調控因子，所以miRNA可能通過某些途徑調節(jié)成脂相關的轉錄因子參與到成脂分化的過程中，本文就ADSCs在移植脂肪過程中的分化及其miRNA的表達進行綜述。

1 ADSCs的移植

ADSCs具有來源豐富、應用范圍廣泛、成本低、無瘢痕、可調整等優(yōu)點，易于患者接受，在美容外科有廣闊的應用前景。但是，單獨的顆粒脂肪移植有鈣化、囊腫形成、新生乳房腫瘤難以辨識等并發(fā)癥的可能，為克服常規(guī)注射脂肪移植的問題，目前引起最多關注的是ADSCs輔助移植法。Matsumoto等［3-4］將所取的顆粒脂肪分成兩部分:一部分用于提取ADSCs，一部分用于脂肪移植，提取后混合兩部分共同移植于小鼠皮下，使用ADSCs輔助移植的脂肪體積大于未使用脂肪移植組35%，使用ADSCs輔助移植的脂肪在 Dil染色下血管內皮細胞較未使用脂肪移植組高，而且研究也證實ADSCs可以分化成脂肪細胞并促進脂肪再生，又可以分化成血管內皮細胞和壁細胞，促進血管化作用，為脂肪細胞提供營養(yǎng)，并分泌血管內皮生長因子(VEGF)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)等生長因子，防止脂肪細胞凋亡，因此可以說，ADSCs是維持脂肪移植成活的關鍵因素［5-6］。

2 ADSCs在移植脂肪中的分化情況

一般認為，ADSCs向脂肪分化經歷從多能干細胞、脂肪母細胞、前脂肪細胞、不成熟脂肪細胞到成熟脂肪細胞的過程。目前，人們對多能干細胞向前脂肪細胞分化的這一階段的研究較少，相比之下，前體脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞的過程已經基本闡明。然而，了解了這一過程的作用機制對ADSCs成脂分化有重要的意義。

2．1 調控ADSCs向分化的轉錄調控

脂肪細胞從成纖維細胞樣向圓形轉變的這種形態(tài)學上顯著的改變與細胞外基質成分的水平、類型及細胞支架構成的變化相平行。這些變化同樣也引起一些重要轉錄因子表達的變化，例如 PPARγ、SREBP-1c、ADD-1 和 C/EBPs，對前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化和基因表達模式的轉變起了決定性的開啟作用。

2．1．1 PPARγ PPARγ屬于核受體超家族配體依賴的轉錄因子，是抗糖尿病藥物噻唑烷二酮類的靶點。PPARγ的表達對于白色脂肪組織和棕色脂肪組織的形成都是必需的［7-8］。多能干細胞經PPARγ表達質粒轉染可誘導脂肪細胞生成，促使3T3-L1前體脂肪細胞在無誘導劑存在的情況下，向終末脂肪細胞轉化。PPARγ缺乏的小鼠可因胎盤缺陷而在胚胎期死亡，單純去除PPARγ基因的ADSCs既不能分化為脂肪細胞，也不能參與脂肪組織的形成。

PPARγ由兩種可選擇的啟動子轉錄并形成兩種轉錄本，即PPARγ1和 PPARγ2。PPARγ2特異性表達于脂肪細胞中且隨脂肪細胞分化表達上調，是脂肪細胞分化的決定性因子。應用重組逆轉錄病毒載體介導小鼠PPARγ2基因在NIH3T3成纖維細胞中表達，油紅O染色證實，表達PPARγ2的NIHT3T3成纖維細胞在分化介質中培養(yǎng)分化10 d后，胞漿中明顯積聚了較多的中性脂肪，其細胞形態(tài)也與體內成熟脂肪細胞相似，而且這些細胞表達脂肪細胞特異性標志基因。這些研究結果充分顯示，PPARγ在脂肪細胞分化中發(fā)揮著關鍵的調節(jié)作用［9］。

2．1．2 SREBP-1c 類固醇調節(jié)原件蛋白(SREBP)，是近年來在肝臟中發(fā)現的一類能夠調控不飽和脂肪酸的合成、葡萄糖的代謝以及膽固醇合成的轉錄調控因子。SREBP有三種亞型，即 SREBP-1a，SREBP-1c和 SREBP-2。其中，SREBP-1c在脂肪細胞中高表達，具有促進3T3-L1前體脂肪細胞分化的作用。另外有研究表明，SREBP-1c在脂肪細胞中促進甘油三酯的合成主要通過以下兩種方式:①上調脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A脫羧酶、硬脂酰輔酶A去飽和酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶等基因表達促進甘油三酯合成;②轉錄激活PPARγ表達或通過誘導PPARγ配體表達而增加其生脂活性，促進 ADSCs分化［10］。

2．1．3 ADD-1 ADD-1是 SREBP家族的一種，能夠與PPARγ基因的啟動子結合，在脂肪組織中大量表達。因此，ADD-1也是調控脂肪細胞分化的重要轉錄因子。在前體脂肪細胞的分化過程中，ADD-1的表達升高，3T3-L1前體脂肪細胞中過度表達ADD-1/SREBP-1c可以誘導脂肪細胞特異性基因的表達。PPARγ本身可能就是ADD-1/SREBP-1c作用的一個靶基因，所以ADD-1發(fā)揮作用可能是通過調控PPARγ的表達和激活來進行的。

盡管目前ADD-1的表達調控及其調控脂肪細胞分化的作用機制尚未被完全闡明，但是大量的實驗揭示其在胰島素介導的脂肪細胞分化過程中發(fā)揮著重要的作用。

2．1．4 C/EBPs C/EBPs屬于高度保守的亮氨酸鋅指蛋白家族，包括α、β和δ三種亞型。C/EBPα的表達在 PPARγ之后，在脂肪細胞終末分化中發(fā)揮重要作用。此外，C/EBPα能夠有效促進小鼠成纖維細胞向脂肪細胞分化。C/EBPα在細胞分化早期有抑制有絲分裂的作用，在啟動細胞分化和保持脂肪細胞形態(tài)中有重要作用。敲除C/EBPα的小鼠體內不形成白色脂肪組織，表明C/EBPα在脂肪組織發(fā)育中起到關鍵作用。Lefterova等［11］最近研究揭示，PPARγ和 C/EBPα靶基因具有共區(qū)域化的特征。C/EBPβ和C/EBPδ是ADSCs分化早期的調控因子，主要能夠通過誘導PPARγ和C/EBPα的表達而啟動生脂信號，但隨ADSCs分化其表達量逐漸減少。研究表明，C/EBPβ和C/EBPδ基因敲除鼠脂肪組織發(fā)育受損，而C/EBPβ和C/EBPδ基因缺失的ADSCs成脂分化能力也顯著下降。

2．2 調控ADSCs脂向分化的信號通路

多種激素和生長因子在ADSCs分化過程中發(fā)揮著重要的作用。這些激素或生長因子在作用于脂肪細胞膜表面的特異受體后，經不同信號通路的信號傳遞，通過直接或間接的修飾調控ADSCs分化的轉錄因子活性，而實現對ADSCs分化的調控。主要的四條信號傳導途徑為:①MAPK途徑;②胰島素和IGF-1激活的酪氨酸激酶途徑;③TGF-β/BMPs途徑;④FGFs信號通路等。

2．2．1 MAPK 通路與 ADSCs分化 Auld 等［12］認為 MAPK通路可使多種核轉錄因子和蛋白激酶等多種底物磷酸化，從而調節(jié)相關基因的轉錄，參與細胞生長、發(fā)育及細胞間的功能同步等多種生理過程。由于ADSCs分化本身是一個多步驟、多調控因素的復雜過程，MAPK可能參與調控每個環(huán)節(jié)。因此，MAPK對其的調節(jié)也是復雜多樣的，在不同階段發(fā)揮不同的作用。

2．2．2 胰島素/IGF-1信號轉導與 ADSCs分化 胰島素/IGF-1是最早被發(fā)現能夠促進脂肪細胞分化的因子。由于脂肪細胞表面的胰島素受體很少，大多是通過IGF-1受體激活的PI3K/Akt通路發(fā)揮其作用的。PI3K激活Akt/PKB后，GLUT1和GLUT4轉位到細胞膜上，攝取葡萄糖，使脂肪細胞中甘油三酯合成增加，導致ADSCs分化［13］。

2．2．3 TGF-β/BMPs信號轉導與 ADSCs分化 TGF-β 及其信號組分在體外培養(yǎng)的脂肪細胞和脂肪組織中均有表達。但是，TGF-β在體外培養(yǎng)條件下能抑制前體脂肪細胞的分化，超表達TGF-β會損害脂肪組織的發(fā)育。阻斷內源性的TGF-β通路能促進脂肪形成。

BMPs對ADSCs的作用又依賴于BMP的類型和濃度，以及前體細胞的類型和其他調節(jié)物的參與。BMP2的功能更復雜并依賴于其他信號分子的參與。BMP4能使ADSCs定向為脂肪細胞譜系，并完成向脂肪細胞的分化。小鼠缺乏BMP2和BMP4都會在胚胎發(fā)育早期死亡，而這時脂肪細胞還沒有開始發(fā)育，因此，BMP2和BMP4的作用還有待深入研究。但是，Jin等［14］的研究表明，BMP信號通路的中間物Schnurri2(SHN2)在體內和體外都是成脂分化所必須的，其功能是作為連接Smad1，Smad4和C/EBPα與PPARγ啟動子的支架。

2．2．4 FGFs信號與 ADSCs分化 最近的研究表明，FGFs在脂肪形成中發(fā)揮著積極的作用。FGF1是微血管內皮細胞釋放的一種物質，它在人前體脂肪細胞中具有促成脂活性。FGF2植入小鼠子宮，甚至耳軟骨或肌肉中都能誘導脂肪組織的發(fā)育。FGF10在白色脂肪組織的間質脈管細胞中表達，也在3T3-L1細胞脂肪形成的早期表達。

2．3 ADSCs在成脂分化過程中細胞的組織學特點及其相關檢測

ADSCs經成脂誘導3 d后，倒置顯微鏡觀察細胞體積增大，由梭形變?yōu)閳A形或多角形，最為顯著的改變是細胞呈多極突起，且突起細長，而且位于核周的小部分細胞質內開始出現很小的折光性很強的脂滴。誘導后7 d，部分細胞脂滴增多，有的脂滴聚集成較大的脂泡，脂肪細胞呈灶狀分布。誘導后14 d，絕大部分細胞已變成脂肪細胞，細胞多呈圓形或橢圓形，細胞質內可見大量脂滴［15］。油紅 O染色可見脂滴被染成紅色，呈強陽性［16］。對照組僅有極少數細胞出現脂滴聚集，大多細胞油紅O染色呈陰性。此外，也可以抽取誘導7～10 d的脂肪細胞的總RNA，RT-PCR檢測脂肪細胞的特異性基因PPARγ的表達，利用圖像分析軟件分析PCR產物/β-actin灰度比值［17］。當然還有其他檢測方法可以證實ADSCs的成脂分化，如定位熒光標記細胞，伊紅染色等。

3 ADSCs脂向分化過程中miRNA的表達

脂肪細胞分化過程受到大量miRNA影響，其中一些miRNA能夠顯著地調節(jié)脂肪細胞的分化，如miR-16、miR-17-92、miR-21、miR-27a、miR-27b、和 miRNA-134 等。

3．1 miR-16

miR-16是miRNAs中的一員，其作用十分廣泛。Wang等［18］認為miR-16等microRNA的表達變化可以控制細胞的生長速度;Calin等［19］認為miR-16通過BCL2(細胞凋亡調節(jié)子)調控細胞凋亡，miR-16還參與調控細胞因子的RNA的不穩(wěn)定性。結果顯示miR-16在脂肪基質細胞脂向分化過程中表達顯著下調，所以推測miR-16可能通過調控PPARγ、SREBP-1c、ADD1和C/EBPs等在脂肪基質細胞脂向分化過程中重要的轉錄因子中的一種或幾種，從而在ADSCs脂向分化過程發(fā)揮作用［20］。

3．2 miR-17-92

Wang等［21］的研究表明，miR-17-92通過靶向 Rb2/p130的mRNA而促進前體脂肪細胞分化。前體脂肪細胞發(fā)生融合和生長抑制后，再在激素等的刺激下進入細胞周期，才開始分化。然而在此期間，轉錄因子E2F作用于細胞由G1期向S期的轉化，而Rb2/p130與E2F的結合抑制了E2F功能的發(fā)揮進而抑制了細胞分化。miR-17-92能結合在Rb2/p130的RNA上，通過減少Rb2/p130的表達促進脂肪細胞的分化［22］。

3．3 miR-21

王偉新等［23］研究表明，miRNA-21的表達在 ADSCs脂向分化過程中顯著下調，并經實時定量聚合酶鏈反應實驗證實這一結果，提示 miRNA-21參與了 ADSCs的脂向分化過程，所以推測 miRNA-21可能通過 PPARγ、SREBP-1c、ADD1和C/EBPs等轉錄因子，在ADSCs的成脂分化中調控信號傳導通路，實現其在ADSCs成脂方向的作用。

3．4 miR-27a和 miR-27b

肖金剛等［24］的研究顯示，miR-27a和miR-27b在 ADSCs向脂肪細胞分化的過程中表達顯著下調。miR-27a和miR-27b可調控個體的早期發(fā)育和細胞分化，通過作用于抗血管形成的基因而促進血管發(fā)生［25］。生物信息學分析表明PPARγ是miR-27a和 miR-27b的靶基因之一，PPARγ是脂肪細胞發(fā)育和脂肪形成過程中特異的核心轉錄調控因子，可促進脂肪細胞分化，所以miR-27a和miR-27b可能是通過調控PPARγ的表達進而促進ADSCs的脂向分化。

3．5 miR-134

miR-134作為miRNA家族中的成員之一，可以單獨促進人類胚胎干細胞的分化。王黎等［26］研究證實，miR-134在ADSCs脂向分化過程中表達顯著下調，原因可能是miR-134與抑制凋亡的基因 Bcl-2、Bcl-XL、Bcg-l、Tbx3(T-box3)等中的一種或幾種翻譯出的mRNA結合減少，降低或消除對這些基因的抑制，使抑制凋亡的基因發(fā)揮作用，參與MAPK、Insulin/IGF-1、TGFβ/BMPs和 FGFs等信號轉導途徑，為 ADSCs向脂肪細胞方向分化創(chuàng)造促進條件。

4 結語

ADSCs的成脂分化受各種miRNA的影響，經不同信號通路的信號傳遞，通過直接或間接的修飾調控ADSCs分化的轉錄因子活性，從而實現對ADSCs分化為成熟脂肪細胞并部分參與構成移植物脂肪的調控。另外，ADSCs在移植后的急性期處于缺氧的環(huán)境，可以以旁分泌的形式釋放可溶性血管形成因子，促進移植物的新生血管形成，使得更多的脂肪組織更早的建立血運，獲取營養(yǎng)，提高其存活率，所以，ADSCs輔助移植作為一種細胞療法具有一定意義，但能否解決臨床上ADSCs移植的根本問題，仍需進一步研究。

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Differentiation and miRNA expressiom of adipose-derived stem cells in fat transplantation

YUAN Zhi-jian1，ZHOU Hong1，HE Xiao-sheng2，HE Wen-juan1
(1．Wuxi Higher Health Vocational Technical School，Wuxi 214028，China;2．School of Clinical Medicine，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310016，Chian)

Q813

A

1005-1678(2012)06-0924-04

2012-06-21

江蘇省衛(wèi)生廳衛(wèi)生科研項目(編號:J201117)

袁志堅，男，副教授，E-mail:yzj0126@yahoo．com．cn;何曉升，男，通信作者，E-mail:hexs@163．com。