應(yīng)俊，邵海剛，潘若望，李佩珍，張洪勤，曾興業(yè)

（1.溫州醫(yī)學(xué)院 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心；2.溫州醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院；3.中國人民解放軍第118醫(yī)院外科，浙江 溫州 325000）

橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）是一種器官特異性免疫疾病，屬于自身免疫性甲狀腺?。╝utoimmune thyroid disease，AITD）的一種，在自身免疫性甲狀腺炎中位居榜首，約占7.3%～20.5%，男女患病比例為1:6～1:10[1]。溫州地區(qū)位于我國東南沿海，甲狀腺疾病是當(dāng)?shù)氐某Ｒ姴≈?，其發(fā)病率明顯高于內(nèi)陸地區(qū)[2]。HT發(fā)病機(jī)制至今尚未徹底闡明，目前普遍認(rèn)為，HT是環(huán)境和遺傳共同作用的多基因遺傳性疾病，其中遺傳因素在HT的發(fā)病中起著十分重要的作用。為進(jìn)一步明確病因，我們對(duì)HT患者進(jìn)行了基因檢測，觀察溫州地區(qū)漢族人群細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4）外顯子1第49位點(diǎn)和PTPN基因啟動(dòng)子-1123位點(diǎn)是否存在多態(tài)性以及與HT的相關(guān)性，探討HT的遺傳背景。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 為溫州地區(qū)漢族人，均排除其他自身免疫性疾病史和嚴(yán)重的心、肝、腎疾病。①HT組：選自2006年9月-2011年3月就診于溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院、解放軍118醫(yī)院內(nèi)分泌科的HT患者150例，其中男60例，女90例，年齡40～53歲，平均（46.8±5.6）歲。HT的診斷依據(jù)為典型的臨床表現(xiàn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢查，詳見森田陸標(biāo)準(zhǔn)[3]。②健康對(duì)照（CN）組：從我院體檢中心按HT患者的年齡分布、性別構(gòu)成隨機(jī)選取健康體檢者120例，其中男48例，女72例，年齡39～55歲，平均（45.7±6.4）歲。兩組患者年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 方法 用5% Chelex-100快速提取法[4]提取模板DNA。利用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)進(jìn)行CTLA-4的外顯子1+49位的多態(tài)性分析，上游引物：5’-GAAGGATGGTGCTTCACA GAT-3’，下游引物：5’-CTTTGCAGAAGACAGGGATGA-3’，上海捷瑞公司合成。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min→94 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)→72 ℃ 7 min→4 ℃保存，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色后觀察結(jié)果。

利用單一等位基因特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SASP）技術(shù)進(jìn)行PTPN基因啟動(dòng)子-1123SNP分析。PTPN22-1123 G > C F1：5’- CATTGAGAGGTTATG CAAGCTC-3’，F(xiàn)2：5’-CATTGAGAGGTTATGCAAGCTG-3’，R：5’-ACCCTGCATATGTAATGCTGGT-3’（上海捷瑞公司合成）。PCR產(chǎn)物全長268 bp，每份標(biāo)本均使用F1和F2進(jìn)行擴(kuò)增，F(xiàn)1與R組成一對(duì)引物擴(kuò)增G等位基因，F(xiàn)2與R組成一對(duì)引物擴(kuò)增C等位基因，根據(jù)PCR產(chǎn)物的有無區(qū)分基因型。以0.2μg DNA為模板在反應(yīng)體積為30μL內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min→94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35個(gè) 循環(huán)→72 ℃ 7 min→4 ℃保存，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，溴化乙啶顯色，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。以Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)確認(rèn)研究樣本的群體代表性，運(yùn)用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算各組基因頻率及等位基因頻率。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTLA-4基因外顯子1+49A>G位點(diǎn)的PCR-RFLP分析 CTLA-4外顯子1的PCR擴(kuò)增片段長度為652 bp，經(jīng)Bbv I酶切可得到3種結(jié)果：49A/G SNP為基因型AA時(shí)產(chǎn)生556 bp和96 bp 2個(gè)片段；基因型GG時(shí)產(chǎn)生480 bp、96 bp和76 bp 3個(gè)片段；基因型AG時(shí)產(chǎn)生556 bp、480 bp、96 bp和76 bp 4個(gè)片段。由于96 bp和76 bp相對(duì)分子質(zhì)量小，電泳只顯示556 bp 和480 bp（見圖1）。

圖1 CTLA-4外顯子1酶切產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖（M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：PCR產(chǎn)物；2：AA純合型；3：GG純合型；4：AG雜合型）

2.2 PTPN22基因啟動(dòng)子-1123位點(diǎn)的SASP-PCR分析 PTPN22啟動(dòng)子擴(kuò)增片段的長度為268 bp，引物F1針對(duì)等位基因G，引物F2針對(duì)等位基因C。-1123SNP為GG基因型時(shí)F1可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物；CC基因型時(shí)F2可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物；GC基因型時(shí)2對(duì)引物均可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物（見圖2）。

圖2 PTPN基因啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖（1、2：CC純合型；3、4：GG純合型；5、6：GC雜合型；7：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)）

2.3 CTLA-4+49A>G位點(diǎn)（rs231775）多態(tài)性在溫州漢族人群HT組和CN組間各基因型及等位基因頻率比較 CTLA-4 49A>G SNP基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，兩組各基因型和等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1）。

表1 HT組和CN組CTLA-4基因（rs231775）基因型及等位基因分布頻率比較

2.4 PTPN22啟動(dòng)子-1123G>C位點(diǎn)（rs2488457）多態(tài)性在溫州地區(qū)漢族人群HT組和CN組間各基因型及等位基因頻率比較 PTPN22-1123G>C SNP基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，兩組各基因型和等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表2）。

表2 HT組和CN組PTPN22基因（rs2488457）基因型和等位基因分布頻率比較

2.5 CTLA-4 +49 A>G位點(diǎn)（rs231775）、PTPN22啟動(dòng)子-1123G>C位點(diǎn)（rs2488457）基因多態(tài)性對(duì)HT的相對(duì)危險(xiǎn)度 CTLA-4基因rs231775位點(diǎn)相對(duì)AA基因型而言，GG基因型能顯著增加HT發(fā)生的危險(xiǎn)性；PTPN22基因rs2488457位點(diǎn)相對(duì)于GG基因型而言，GC與GG+GC基因型均能顯著增加HT發(fā)生的危險(xiǎn)性。等位基因頻率的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析發(fā)現(xiàn)，CTLA-4外顯子1+49位點(diǎn)G等位基因攜帶者患HT的風(fēng)險(xiǎn)是A等位基因的1.616倍（OR=1.616，95%CI：1.142～2.285），PTPN22啟動(dòng)子-1123位點(diǎn)C等位基因攜帶者患HT的風(fēng)險(xiǎn)是G等位基因的1.459倍（OR=1.459，95%CI：1.034～2.059）。具體見表3。

表4 CTLA-4基因和PTPN22基因的多態(tài)性對(duì)HT的相對(duì)危險(xiǎn)度

3 討論

HT是一種器官特異性的自身免疫性疾病，其發(fā)病涉及免疫、遺傳、環(huán)境等因素，但是確切的機(jī)制尚未明了。不同基因和不同的環(huán)境因子在不同人群中起著不同的作用，因此確定HT易感性的相關(guān)基因成為國內(nèi)外病因?qū)W研究熱點(diǎn)之一。

近年的研究表明：CTLA-4基因多態(tài)性與多種自身免疫性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，提示其可能是一新的自身免疫性疾病的遺傳易感基因，已成為目前研究的熱點(diǎn)。許多研究均證明CTLA-4基因外顯子1+49位點(diǎn)存在的多態(tài)性與自身免疫性疾病密切相關(guān)，但所顯示的結(jié)果并不完全一致。Antonio等[5]報(bào)道意大利人群中CTLA-4外顯子1+49A/G的多態(tài)性與AITD呈顯著相關(guān)，Bicek等[6]、Esteghamati等[7]、王巧宏等[8]也均支持49位點(diǎn)G等位基因是AITD的危險(xiǎn)因素之一；另外， Namo Cury等[9]探討了巴西人CTLA-4+49A/G的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；師志云等[10]發(fā)現(xiàn)49位點(diǎn)G等位基因與Graves病顯著相關(guān)，與HT的發(fā)生無關(guān)。說明CTLA-4基因多態(tài)性存在民族、地區(qū)之間的差異。本研究發(fā)現(xiàn)HT組CTLA-4+49A/G基因型頻率、等位基因頻率與CN組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，+49位點(diǎn)帶有A/A基因型的個(gè)體對(duì)HT的發(fā)生具有一定的抵抗能力，即那些帶有G/G基因型的個(gè)體對(duì)HT具有易感性。此外，疾病組+49G等位基因頻率顯著高于對(duì)照組（OR=1.616，95%CI：1.142～2.285，P=0.007）。49位點(diǎn)A/G的二態(tài)性導(dǎo)致蘇氨酸/丙氨酸的交換可影響前導(dǎo)鏈的構(gòu)成，使之不能正確引導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)CTLA-4分子運(yùn)輸致使細(xì)胞表面CTLA-4分子減少，而引起HT的發(fā)生。對(duì)HT發(fā)病的確切機(jī)制以及如何利用CTLA-4的負(fù)性調(diào)節(jié)作用來誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受而控制疾病的發(fā)生等則有待于進(jìn)一步研究和探討。

蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22（protein tyrosine phosphatase nonreceptor-22，PTPN 22）基因被認(rèn)為是HLA、CTLA-4之外最為重要的人類自身免疫性疾病的易感基因，定位于1p13，編碼淋巴蛋白酪氨酸磷酸酶（lymphoid protein tyrosine phosphatase，LYP），在T細(xì)胞信號(hào)通路里起著負(fù)調(diào)節(jié)作用。第一個(gè)被識(shí)別的PTPN22基因多態(tài)性是位于620密碼子1858位C/T，該多態(tài)性造成精氨酸到色氨酸突變[11]。最近，日本學(xué)者Kawasaki等[12]通過對(duì)TID患者PTPN22全基因掃描的研究發(fā)現(xiàn)日本人群有5個(gè)新的SNP位點(diǎn)，其中-1123G>C突變是另外一個(gè)與自身免疫病發(fā)病甚為相關(guān)的、出現(xiàn)頻率較高的突變位點(diǎn)，結(jié)果顯示一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域的SNP-1123G>C與快速發(fā)病型的1型糖尿病相關(guān)，這種關(guān)聯(lián)在日本人群、朝鮮族人群和高加索人群中均有發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示PTPN22-1123G>C（rs2488457）多態(tài)性位點(diǎn)存在三種基因型，相對(duì)于GG基因型而言，GC與GG+GC基因型均能顯著增加HT發(fā)生的危險(xiǎn)性；-1123C等位基因攜帶者患HT的風(fēng)險(xiǎn)是G等位基因的1.459倍（OR=1.459，95%CI：1.034～2.059）?？梢?，PTPN22基因啟動(dòng)子的-1123G>C SNP與溫州漢族人群HT的發(fā)生有相關(guān)性，與于志云等[13]報(bào)道該位點(diǎn)的SNP與Graves病的發(fā)生相關(guān)的結(jié)果一致。目前關(guān)于-1123位點(diǎn)基因多態(tài)性如何影響LYP的表達(dá)仍不明確，但是分析該位點(diǎn)周圍基因DNA序列，發(fā)現(xiàn)-1123G與轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白4（AP-4）的結(jié)合位點(diǎn)匹配，而且正好落于AP-4結(jié)合共有序列的核心位置上（-1130gcaaGCTGaa-1121）[14]，而-1123C等位基因不能與任何已知的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合元素相匹配，可能因此影響了Lyp的轉(zhuǎn)錄效率。但關(guān)于PTPN22-1123位點(diǎn)基因多態(tài)性在HT的發(fā)生、發(fā)展過程中產(chǎn)生作用的具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的研究。

HT是一種多基因遺傳性疾病，基因之間的相互作用可能影響疾病的發(fā)生。我們的研究提示CTLA-4基因和PTPN22基因都是HT的易感基因，兩基因均為突變時(shí)增加了HT發(fā)生的機(jī)會(huì)。即說明兩基因的變異對(duì)疾病的發(fā)生起協(xié)同作用，對(duì)這一協(xié)同作用的病理生理基礎(chǔ)的解釋還有待于更深入的研究。

總之，作為一種多基因疾病，HT遺傳易感性可能由多個(gè)外顯率不同的基因決定，不同的環(huán)境因素以及環(huán)境因素與遺傳易感因素之間的相互作用，決定了HT的發(fā)生發(fā)展。因此，不僅要關(guān)注以環(huán)境因素為主導(dǎo)作用的致病因素，還應(yīng)從基因水平進(jìn)行探討，CTLA-4基因、PTPN22基因多態(tài)性類型將可能對(duì)HT等自身免疫性疾病的發(fā)展、診斷、治療（包括基因治療）提供新的思路。

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