朱憶凌,周新木,龔偉,黎慶榮,黃淵
(麗水市中心醫(yī)院暨溫州醫(yī)學(xué)院附屬第五醫(yī)院 病理科,浙江 麗水 323000)
免疫組化技術(shù)已常規(guī)應(yīng)用于病理診斷工作中,在病理診斷、術(shù)后治療和預(yù)后評(píng)估等方面發(fā)揮了重要作用。乳腺癌術(shù)后雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR),以及原癌基因CerbB-2的測(cè)定,已廣泛應(yīng)用于臨床。ER、PR陽(yáng)性表達(dá)為術(shù)后內(nèi)分泌治療提供了理論依據(jù);CerbB-2是乳腺癌預(yù)后不良的重要指標(biāo)之一,其過(guò)度表達(dá)提示腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)率高,對(duì)化療和內(nèi)分泌治療不敏感[1]。目前,大多數(shù)醫(yī)院采用國(guó)內(nèi)通用標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定CerbB-2染色結(jié)果的陽(yáng)性強(qiáng)度,但是在判讀中存在主觀上的不穩(wěn)定性,尤其是CerbB-2++的判讀可重復(fù)性不高[2]。ER、PR免疫組化染色結(jié)果目前尚無(wú)統(tǒng)一判斷標(biāo)準(zhǔn)。另外,免疫組化技術(shù)本身影響質(zhì)量的因素較多,設(shè)置適當(dāng)?shù)膶?duì)照在乳腺癌免疫組化實(shí)驗(yàn)中是質(zhì)量控制的關(guān)鍵。組織芯片具有體積小、信息含量高、快速、低消耗和可比性強(qiáng)等特點(diǎn)[3],我們利用組織芯片制作的原理,改進(jìn)芯片制作技術(shù),在同一張切片上設(shè)立等級(jí)表達(dá)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,使得染色結(jié)果判讀更為可靠,觀察更加客觀和方便,且方法簡(jiǎn)便可行,現(xiàn)介紹如下。
1.1 材料 從我院病理科檔案免疫組化染色切片中篩選出乳腺癌ER、PR和CerbB-2具有清晰染色結(jié)果的病例,獲得表達(dá)水平依次為-、+、++和+++的乳腺癌組織。自制采樣器(內(nèi)徑1.8 mm的平頭穿刺套管一套),APES涂膠片,免疫組化試劑一抗ER、PR和CerbB-2及EnVision TM Plus檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
1.2 染色結(jié)果的判斷 CerbB-2免疫組化染色結(jié)果采用國(guó)內(nèi)通用標(biāo)準(zhǔn),陽(yáng)性表達(dá)位于腫瘤細(xì)胞的胞膜,根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行分組。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):未見(jiàn)著色或<10%的腫瘤細(xì)胞膜著色,或僅有胞質(zhì)非特異著色為-;>10%的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá),顯色弱且不連續(xù)為+;>10%的腫瘤細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá),連續(xù)胞膜顯色,強(qiáng)度中等為++;>10%的腫瘤細(xì)胞膜呈連續(xù)的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)為+++[1]。ER、PR以細(xì)胞核內(nèi)有棕色顆粒為陽(yáng)性,采用陽(yáng)性百分比計(jì)數(shù)法:陽(yáng)性表達(dá)<10%為-;陽(yáng)性表達(dá)10%~30%為+;陽(yáng)性表達(dá)30%~50%為++;陽(yáng)性表達(dá)>50%為+++[4]。
1.3 組織芯片對(duì)照片的構(gòu)建 復(fù)查HE及免疫組化染色切片,選擇最具代表性的區(qū)域,畫(huà)圈標(biāo)記,再在組織蠟塊上相應(yīng)的區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記。用自制采樣器,從供體蠟塊中采集組織芯,并按-、+、++和+++的次序依次放好。取出1 cm×1 cm包埋模具,先在模具底部滴入少許蠟液,放置加熱臺(tái)使其熔化,依次放入所取組織芯,緊密排成一行,然后將模具移置冷卻臺(tái)稍冷卻,使組織芯位置稍固定后如同常規(guī)一般完成包埋。包埋盒書(shū)寫(xiě)號(hào)碼側(cè)與陰性對(duì)照一側(cè)一致。將組織芯片蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片,厚度4μm,裱貼APES涂膠載玻片的一端。60 ℃烤箱內(nèi)烤片一夜后取出,儲(chǔ)藏于干燥的切片盒內(nèi)備用。
1.4 免疫組化染色 當(dāng)常規(guī)病例需要做免疫組化染色時(shí),從備用盒中取出1張對(duì)照芯片,將常規(guī)測(cè)試病例組織切片后,裱在對(duì)照芯片旁邊,然后同時(shí)進(jìn)行烤片、脫蠟、高壓抗原熱修復(fù)以及免疫組化EnVision染色,DAB顯色,蘇木精襯染,脫水、透明封固(見(jiàn)圖1)。
圖1 采樣器、制成的蠟塊與對(duì)照芯片
手工制作對(duì)照芯片耗時(shí)短,方法簡(jiǎn)便,組織蠟芯排列整齊有序,無(wú)移位。在免疫組化染色時(shí)對(duì)對(duì)照芯片進(jìn)行了測(cè)試,對(duì)照芯片無(wú)皺褶,抗原修復(fù)時(shí)無(wú)掉片。對(duì)照芯片與被測(cè)組織相鄰,界限清楚,易于閱片,并且不影響被測(cè)組織的染色。對(duì)照芯片中乳腺癌組織ER、PR及CerbB-2-、+、++和+++免疫組化染色陽(yáng)性信號(hào)清楚,強(qiáng)弱有差異,反映出乳腺癌組織中各抗原含量不同。顯微鏡下觀察,對(duì)照芯片排列整齊,閱片者很容易相互參照查對(duì)陽(yáng)性點(diǎn)位的染色狀況(見(jiàn)圖2-3),可以根據(jù)對(duì)照片內(nèi)的組織染色狀況判定受測(cè)組織是否進(jìn)行了正確的染色過(guò)程,并且可以參照已知的陽(yáng)性對(duì)照片染色給予受測(cè)組織較客觀的判讀。
乳腺癌為女性高發(fā)腫瘤,近幾年發(fā)病率逐年上升,而病死率卻逐年下降。這在很大程度上得益于對(duì)患者病情的準(zhǔn)確判斷及有針對(duì)性的治療。檢測(cè)乳腺癌ER、PR及CerbB-2表達(dá)情況,可指導(dǎo)內(nèi)分泌治療和靶向治療,因此乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫組化檢測(cè)的質(zhì)量控制顯得十分重要[5]。
圖2 CerbB-2免疫組化結(jié)果模式圖
圖3 PR免疫組化結(jié)果模式圖
在進(jìn)行乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫組化染色時(shí),為了確保染色片的質(zhì)量和判讀結(jié)果的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性,必須設(shè)立合理的對(duì)照,避免假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果以及主觀判讀的不穩(wěn)定性。而通常的免疫組化對(duì)照法常采用外對(duì)照實(shí)驗(yàn),抗體種類(lèi)越多,準(zhǔn)備的外對(duì)照切片種類(lèi)就越多,因此組織耗費(fèi)多且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力;同時(shí)由于陽(yáng)性對(duì)照組織與待測(cè)組織不在同一張載玻片上,實(shí)驗(yàn)條件無(wú)法達(dá)到完全一致[6],如各步驟的時(shí)間、試劑的用量、抗原修復(fù)狀況或其他人為因素等存在差異,均可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,使得免疫組化結(jié)果的判讀缺乏可靠性。并且僅做強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照片對(duì)照評(píng)估乳腺癌ER、PR和CerbB-2免疫組化染色結(jié)果是不準(zhǔn)確的,對(duì)于強(qiáng)陽(yáng)性病例,即使染色敏感性降低,仍可能呈陽(yáng)性表達(dá),因此乳腺癌免疫組化實(shí)驗(yàn)中制作單一抗體的不同陽(yáng)性程度的對(duì)照片十分必要[7]。
我們運(yùn)用組織芯片技術(shù)在乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫組化染色中設(shè)立等級(jí)對(duì)照具備以下優(yōu)點(diǎn):①組織芯片可根據(jù)不同需要進(jìn)行組合和靈活設(shè)計(jì),鑒于乳腺癌免疫組化染色結(jié)果判讀的要求,我們選取以往ER、PR、CerbB-2免疫組化染色信號(hào)為-、+、++和+++表達(dá)清楚的乳腺癌組織為對(duì)照,制成對(duì)照芯片。陰性和不同等級(jí)的陽(yáng)性組織均包含在內(nèi),比傳統(tǒng)的單一陽(yáng)性對(duì)照更可靠,更有效。②檢測(cè)組織和對(duì)照芯片在同一張載玻片上,在相同條件下進(jìn)行免疫組化染色,保證了實(shí)驗(yàn)條件的一致性,使結(jié)果更具可比性。③組織芯片對(duì)照片排列規(guī)整,與被測(cè)組織相鄰,界線(xiàn)清楚,非常方便診斷醫(yī)師閱片和查對(duì)。④組織芯面積很小,供體蠟塊被破壞程度小,取出組織芯后,供體蠟塊仍可存檔保留。同時(shí)免疫組化染色切片歸檔保存時(shí)不需要另外單獨(dú)保存陽(yáng)性對(duì)照切片,更有利于檔案管理。⑤組織芯蠟塊制備后,可以一次性連續(xù)切取對(duì)照組織芯片數(shù)張,烤片后備用。為保證對(duì)照芯片的有效性,我們對(duì)不同保存時(shí)間的芯片進(jìn)行免疫組化染色,結(jié)果證明對(duì)照芯片在室溫條件下保存6個(gè)月內(nèi),其抗原性保存較好,不會(huì)出現(xiàn)抗原丟失,避免了重復(fù)切片造成的修片損失,且省時(shí)省力。⑥應(yīng)用組織芯片技術(shù)制作使用的陽(yáng)性對(duì)照組織比較小,節(jié)約了試劑的使用,降低了成本。⑦經(jīng)過(guò)對(duì)組織芯片制作過(guò)程的改良,用自制采樣器手工組織芯片制作過(guò)程十分簡(jiǎn)單,花費(fèi)時(shí)間少。取樣后,將組織芯按次序放入模具內(nèi)按常規(guī)方法包埋,避免了用空白蠟塊打孔后將組織芯埋入時(shí)出現(xiàn)的融合不夠?qū)е虑衅щy、組織缺失、飄散的現(xiàn)象。
總之,乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫組化染色設(shè)立等級(jí)對(duì)照十分必要,手工自制對(duì)照芯片方法簡(jiǎn)單,花費(fèi)成本低,實(shí)用性強(qiáng),值得臨床推廣應(yīng)用。
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