朱憶凌，周新木，龔偉，黎慶榮，黃淵

（麗水市中心醫(yī)院暨溫州醫(yī)學(xué)院附屬第五醫(yī)院 病理科，浙江 麗水 323000）

免疫組化技術(shù)已常規(guī)應(yīng)用于病理診斷工作中，在病理診斷、術(shù)后治療和預(yù)后評(píng)估等方面發(fā)揮了重要作用。乳腺癌術(shù)后雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR），以及原癌基因CerbB-2的測(cè)定，已廣泛應(yīng)用于臨床。ER、PR陽(yáng)性表達(dá)為術(shù)后內(nèi)分泌治療提供了理論依據(jù)；CerbB-2是乳腺癌預(yù)后不良的重要指標(biāo)之一，其過(guò)度表達(dá)提示腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)率高，對(duì)化療和內(nèi)分泌治療不敏感[1]。目前，大多數(shù)醫(yī)院采用國(guó)內(nèi)通用標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定CerbB-2染色結(jié)果的陽(yáng)性強(qiáng)度，但是在判讀中存在主觀上的不穩(wěn)定性，尤其是CerbB-2++的判讀可重復(fù)性不高[2]。ER、PR免疫組化染色結(jié)果目前尚無(wú)統(tǒng)一判斷標(biāo)準(zhǔn)。另外，免疫組化技術(shù)本身影響質(zhì)量的因素較多，設(shè)置適當(dāng)?shù)膶?duì)照在乳腺癌免疫組化實(shí)驗(yàn)中是質(zhì)量控制的關(guān)鍵。組織芯片具有體積小、信息含量高、快速、低消耗和可比性強(qiáng)等特點(diǎn)[3]，我們利用組織芯片制作的原理，改進(jìn)芯片制作技術(shù)，在同一張切片上設(shè)立等級(jí)表達(dá)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，使得染色結(jié)果判讀更為可靠，觀察更加客觀和方便，且方法簡(jiǎn)便可行，現(xiàn)介紹如下。

1 材料和方法

1.1 材料 從我院病理科檔案免疫組化染色切片中篩選出乳腺癌ER、PR和CerbB-2具有清晰染色結(jié)果的病例，獲得表達(dá)水平依次為-、+、++和+++的乳腺癌組織。自制采樣器（內(nèi)徑1.8 mm的平頭穿刺套管一套），APES涂膠片，免疫組化試劑一抗ER、PR和CerbB-2及EnVision TM Plus檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 染色結(jié)果的判斷 CerbB-2免疫組化染色結(jié)果采用國(guó)內(nèi)通用標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性表達(dá)位于腫瘤細(xì)胞的胞膜，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行分組。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：未見(jiàn)著色或<10%的腫瘤細(xì)胞膜著色，或僅有胞質(zhì)非特異著色為-；>10%的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，顯色弱且不連續(xù)為+；>10%的腫瘤細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá)，連續(xù)胞膜顯色，強(qiáng)度中等為++；>10%的腫瘤細(xì)胞膜呈連續(xù)的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)為+++[1]。ER、PR以細(xì)胞核內(nèi)有棕色顆粒為陽(yáng)性，采用陽(yáng)性百分比計(jì)數(shù)法：陽(yáng)性表達(dá)<10%為-；陽(yáng)性表達(dá)10%～30%為+；陽(yáng)性表達(dá)30%～50%為++；陽(yáng)性表達(dá)>50%為+++[4]。

1.3 組織芯片對(duì)照片的構(gòu)建 復(fù)查HE及免疫組化染色切片，選擇最具代表性的區(qū)域，畫(huà)圈標(biāo)記，再在組織蠟塊上相應(yīng)的區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記。用自制采樣器，從供體蠟塊中采集組織芯，并按-、+、++和+++的次序依次放好。取出1 cm×1 cm包埋模具，先在模具底部滴入少許蠟液，放置加熱臺(tái)使其熔化，依次放入所取組織芯，緊密排成一行，然后將模具移置冷卻臺(tái)稍冷卻，使組織芯位置稍固定后如同常規(guī)一般完成包埋。包埋盒書(shū)寫(xiě)號(hào)碼側(cè)與陰性對(duì)照一側(cè)一致。將組織芯片蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，厚度4μm，裱貼APES涂膠載玻片的一端。60 ℃烤箱內(nèi)烤片一夜后取出，儲(chǔ)藏于干燥的切片盒內(nèi)備用。

1.4 免疫組化染色 當(dāng)常規(guī)病例需要做免疫組化染色時(shí)，從備用盒中取出1張對(duì)照芯片，將常規(guī)測(cè)試病例組織切片后，裱在對(duì)照芯片旁邊，然后同時(shí)進(jìn)行烤片、脫蠟、高壓抗原熱修復(fù)以及免疫組化EnVision染色，DAB顯色，蘇木精襯染，脫水、透明封固（見(jiàn)圖1）。

圖1 采樣器、制成的蠟塊與對(duì)照芯片

2 結(jié)果

手工制作對(duì)照芯片耗時(shí)短，方法簡(jiǎn)便，組織蠟芯排列整齊有序，無(wú)移位。在免疫組化染色時(shí)對(duì)對(duì)照芯片進(jìn)行了測(cè)試，對(duì)照芯片無(wú)皺褶，抗原修復(fù)時(shí)無(wú)掉片。對(duì)照芯片與被測(cè)組織相鄰，界限清楚，易于閱片，并且不影響被測(cè)組織的染色。對(duì)照芯片中乳腺癌組織ER、PR及CerbB-2-、+、++和+++免疫組化染色陽(yáng)性信號(hào)清楚，強(qiáng)弱有差異，反映出乳腺癌組織中各抗原含量不同。顯微鏡下觀察，對(duì)照芯片排列整齊，閱片者很容易相互參照查對(duì)陽(yáng)性點(diǎn)位的染色狀況（見(jiàn)圖2-3），可以根據(jù)對(duì)照片內(nèi)的組織染色狀況判定受測(cè)組織是否進(jìn)行了正確的染色過(guò)程，并且可以參照已知的陽(yáng)性對(duì)照片染色給予受測(cè)組織較客觀的判讀。

3 討論

乳腺癌為女性高發(fā)腫瘤，近幾年發(fā)病率逐年上升，而病死率卻逐年下降。這在很大程度上得益于對(duì)患者病情的準(zhǔn)確判斷及有針對(duì)性的治療。檢測(cè)乳腺癌ER、PR及CerbB-2表達(dá)情況，可指導(dǎo)內(nèi)分泌治療和靶向治療，因此乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫組化檢測(cè)的質(zhì)量控制顯得十分重要[5]。

圖2 CerbB-2免疫組化結(jié)果模式圖

圖3 PR免疫組化結(jié)果模式圖

在進(jìn)行乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫組化染色時(shí)，為了確保染色片的質(zhì)量和判讀結(jié)果的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性，必須設(shè)立合理的對(duì)照，避免假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果以及主觀判讀的不穩(wěn)定性。而通常的免疫組化對(duì)照法常采用外對(duì)照實(shí)驗(yàn)，抗體種類越多，準(zhǔn)備的外對(duì)照切片種類就越多，因此組織耗費(fèi)多且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力；同時(shí)由于陽(yáng)性對(duì)照組織與待測(cè)組織不在同一張載玻片上，實(shí)驗(yàn)條件無(wú)法達(dá)到完全一致[6]，如各步驟的時(shí)間、試劑的用量、抗原修復(fù)狀況或其他人為因素等存在差異，均可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，使得免疫組化結(jié)果的判讀缺乏可靠性。并且僅做強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照片對(duì)照評(píng)估乳腺癌ER、PR和CerbB-2免疫組化染色結(jié)果是不準(zhǔn)確的，對(duì)于強(qiáng)陽(yáng)性病例，即使染色敏感性降低，仍可能呈陽(yáng)性表達(dá)，因此乳腺癌免疫組化實(shí)驗(yàn)中制作單一抗體的不同陽(yáng)性程度的對(duì)照片十分必要[7]。

我們運(yùn)用組織芯片技術(shù)在乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫組化染色中設(shè)立等級(jí)對(duì)照具備以下優(yōu)點(diǎn)：①組織芯片可根據(jù)不同需要進(jìn)行組合和靈活設(shè)計(jì)，鑒于乳腺癌免疫組化染色結(jié)果判讀的要求，我們選取以往ER、PR、CerbB-2免疫組化染色信號(hào)為-、+、++和+++表達(dá)清楚的乳腺癌組織為對(duì)照，制成對(duì)照芯片。陰性和不同等級(jí)的陽(yáng)性組織均包含在內(nèi)，比傳統(tǒng)的單一陽(yáng)性對(duì)照更可靠，更有效。②檢測(cè)組織和對(duì)照芯片在同一張載玻片上，在相同條件下進(jìn)行免疫組化染色，保證了實(shí)驗(yàn)條件的一致性，使結(jié)果更具可比性。③組織芯片對(duì)照片排列規(guī)整，與被測(cè)組織相鄰，界線清楚，非常方便診斷醫(yī)師閱片和查對(duì)。④組織芯面積很小，供體蠟塊被破壞程度小，取出組織芯后，供體蠟塊仍可存檔保留。同時(shí)免疫組化染色切片歸檔保存時(shí)不需要另外單獨(dú)保存陽(yáng)性對(duì)照切片，更有利于檔案管理。⑤組織芯蠟塊制備后，可以一次性連續(xù)切取對(duì)照組織芯片數(shù)張，烤片后備用。為保證對(duì)照芯片的有效性，我們對(duì)不同保存時(shí)間的芯片進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果證明對(duì)照芯片在室溫條件下保存6個(gè)月內(nèi)，其抗原性保存較好，不會(huì)出現(xiàn)抗原丟失，避免了重復(fù)切片造成的修片損失，且省時(shí)省力。⑥應(yīng)用組織芯片技術(shù)制作使用的陽(yáng)性對(duì)照組織比較小，節(jié)約了試劑的使用，降低了成本。⑦經(jīng)過(guò)對(duì)組織芯片制作過(guò)程的改良，用自制采樣器手工組織芯片制作過(guò)程十分簡(jiǎn)單，花費(fèi)時(shí)間少。取樣后，將組織芯按次序放入模具內(nèi)按常規(guī)方法包埋，避免了用空白蠟塊打孔后將組織芯埋入時(shí)出現(xiàn)的融合不夠?qū)е虑衅щy、組織缺失、飄散的現(xiàn)象。

總之，乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫組化染色設(shè)立等級(jí)對(duì)照十分必要，手工自制對(duì)照芯片方法簡(jiǎn)單，花費(fèi)成本低，實(shí)用性強(qiáng)，值得臨床推廣應(yīng)用。

[1] 董春鴿,章杰,吳亮,等. 乳腺癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化與預(yù)后因素的相關(guān)性[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,41(2):132-135.

[2] 王翠芝,周小鴿,黃受方,等.陽(yáng)性對(duì)照組織芯片在乳腺癌CerbB-2免疫組化染色中的應(yīng)用[J].診斷病理學(xué)雜志,2006,13(4):316-317.

[3] 祁旦已,王繁,周伶俐,等.組織芯片技術(shù)檢測(cè)Galectin-3和CD44v6在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,39(1):43-46.

[4] 郭歡續(xù),白歐.乳腺癌ER、PR、Her-2表達(dá)與臨床病理特征[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)雜志,2008,12(11):1390-1393.

[5] 吳秉銓,李玲.HER-2/neu基因和乳腺癌研究進(jìn)展的啟迪[J].中華病理學(xué)雜志,2002,31(3):197-198．

[6] 王翠芝,周小鴿,黃受方,等. 組織芯片在免疫組化染色陽(yáng)性對(duì)照中的應(yīng)用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2006,22(4):481-484.

[7] 郎志強(qiáng),魏兵,唐源,等.免疫組化對(duì)照芯片的設(shè)計(jì)和應(yīng)用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2005,21(2):235-236.