劉昭蓉，羅春芬，朱敏，於林軍，范厲龍

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬臺(tái)州醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 317000，1.小兒外科；2.公共科研平臺(tái)）

平陽霉素（Pingyangmycin，PYM）是一種國產(chǎn)抗腫瘤抗生素。自1991年鄭勤田等[1]首先報(bào)道了PYM局部注射治療各種類型的血管瘤210例有效率達(dá)100%后，國內(nèi)相繼有文獻(xiàn)報(bào)道PYM用于血管瘤、淋巴管瘤及血管畸形患者的治療，取得了較好的療效[2-3]。PYM用于治療血管瘤等疾病的作用機(jī)制研究不多，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為PYM進(jìn)入人體后產(chǎn)生的氧自由基（OFR）通過干擾DNA復(fù)制這一細(xì)胞毒作用造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致血管壁纖維增生、管壁增厚、血栓形成、管腔閉塞[4]。周衛(wèi)兵等[5]通過細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PYM可通過促凋亡機(jī)制抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。筆者從細(xì)胞凋亡水平研究PYM對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926的作用及其機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 EA.hy926細(xì)胞株（購自美國ATCC公司）；0.25%胰蛋白酶、M199細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Gibco BRL公司產(chǎn)品）；MTS/PMS（北京Promega公司提供）；天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-3、ActiveForm（美國BD Biosciences Pharmingen產(chǎn)品）；人Annexin V-FITC/PI試劑盒（美國Qbiogene產(chǎn)品）；BCA蛋白定量試劑（碧云天生物技術(shù)研究所提供）；一抗Caspase-8、Caspase-9、GAPDH及二抗（美國Cell Signaling公司產(chǎn)品）；DAB顯色試劑（美國Sigma公司產(chǎn)品）；注射用PYM粉劑（天津太和制藥有限公司產(chǎn)品）；Novel NIB-100倒置顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司產(chǎn)品）；RT6000酶標(biāo)分析儀（美國Rayto公司產(chǎn)品）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國Biosciences Cell Quest分析軟件）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PYM溶液的配制：將無菌PYM粉劑預(yù)先用無菌0.9%的氯化鈉溶液溶解，配制成濃縮原液（4 mg/mL）儲(chǔ)存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)前用10%血清M199培養(yǎng)液將原液稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.2.2 甲基三氯硅烷 （methyltrichlorosilane，MTS）比色實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞經(jīng)消化離心后，用培養(yǎng)液配制成5×104/mL濃度的EA.hy926細(xì)胞懸液，接種于2塊96孔培養(yǎng)板中。PYM組每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，并設(shè)對(duì)應(yīng)的空白孔（不加EA.hy926細(xì)胞和PYM）和對(duì)照孔（不加PYM），每孔加入細(xì)胞懸液200μL，在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿孔底后，分別加入20μL不同濃度的PYM培養(yǎng)基溶液，使PYM終濃度為2.5、5、10、20、40、160和320μg/mL。2塊板分別作用24和48 h后，每孔加入MTS 40μL，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h。在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（inhibit rate，IR）=[1－（實(shí)驗(yàn)組平均OD值－空白組平均OD值）/（對(duì)照組平均OD值－空白組平均OD值）]×100%[6]。半數(shù)抑制濃度（IC50）采用Logit法計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求平均值。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察：每瓶接種2×105個(gè)/mL個(gè)EA.hy926細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，用 10、20、40、80、160μg/mL PYM分別處理24 h，設(shè)對(duì)照組（0μg/mL PYM），予瑞氏-吉姆薩染色，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：EA.hy926細(xì)胞以2×105個(gè)/mL接種6孔板，PYM分為10、20、40、80和160 μg/mL 5個(gè)濃度組，并設(shè)對(duì)照組（PYM 0μg/mL），每組設(shè)3個(gè)樣本，作用24 h后，測(cè)定：①AnnexinV/FITC/PI：收集經(jīng)PYM作用后的細(xì)胞，每樣本取總數(shù)約為1×105的細(xì)胞，離心、洗滌后重懸于500μL PBS。取200μL細(xì)胞置于預(yù)先已加入200μL結(jié)合緩沖液的流式細(xì)胞儀專用管，加入5μL的AnnexinV/FITC避光孵育15 min，再加入5μL的碘化丙錠溶液（PI）雙染色后，上機(jī)檢測(cè)。②Caspase-3活性：收集各樣本細(xì)胞1×105個(gè)，離心、洗滌后重懸于300 μL結(jié)合緩沖液，移入流式管，加入FITC-DEVD-FMK 1μL，37 ℃、5% CO2溫箱孵育30 min～1 h，再次離心、洗滌后重懸于500μL結(jié)合緩沖液，上機(jī)檢測(cè)。③羅丹明123染色測(cè)定線粒體膜電位：收集各樣本細(xì)胞1×105個(gè)，離心、洗滌后0.5 mL PBS重懸，加羅丹明123 1.25μL，37 ℃水浴5 min，再次離心、洗滌后0.5 mL PBS重懸，移入流式管，上機(jī)檢測(cè)。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)4 次，求平均值。

1.2.5 免疫印跡（Western-blot）法檢測(cè)：EA.hy926細(xì)胞以5×106個(gè)接種培養(yǎng)瓶，PYM分為20、40和80μg/mL 3個(gè)濃度組，并設(shè)對(duì)照組（0μg/mL），作用24 h之后，收集各組細(xì)胞，洗滌、離心后取沉淀，加入RIPA 100μL及PMSF 1μL混勻，冰上裂解2 h后4 ℃離心30 min，取上清，按照BCA法進(jìn)行蛋白定量，參照說明書制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)定標(biāo)本管吸光度值，在曲線中找出相應(yīng)的濃度值，計(jì)算得出需要的上樣量，使蛋白上樣量一致。將40μg蛋白上樣于SDS2-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，4 ℃下PVDF膜與一抗Caspase-8、Caspase-9（濃度均為1:500）及GAPDH（濃度為1:1000）孵育過夜，洗膜后與HRP連接的二抗（濃度均為1:3000)常溫下孵育2 h，用DAB試劑按1:50配比后顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以±s表示，采用方差分析，LSD行兩兩均數(shù)間的多重比較。

2 結(jié)果

2.1 PYM對(duì)EA.hy926細(xì)胞的增殖抑制作用 MTS比色檢測(cè)結(jié)果顯示：2.5～320μg/mL的PYM處理EA.hy926細(xì)胞24、48 h后可明顯抑制細(xì)胞增殖，見表1。各濃度組間兩兩比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在24 h，5μg/mL和10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL、160μg/mL和320μg/mL組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；在48 h，10μg/mL和20μg/mL、20μg/mL和40μg/mL、160μg/mL和320μg/mL組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），提示PYM對(duì)EA.hy926細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與藥物作用濃度有關(guān)，在低濃度即呈現(xiàn)明顯的抑制作用，而達(dá)到160μg/mL后細(xì)胞生長(zhǎng)大部分被抑制，抑制率進(jìn)入平臺(tái)期。PYM處理細(xì)胞24、48 h后，EA.hy926細(xì)胞的IC50分別為14.731μg/mL和6.894μg/mL，提示PYM抑制EA.hy926細(xì)胞生長(zhǎng)具有濃度時(shí)間依賴性。在低濃度組（2.5μg/mL）隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)其抑制率明顯下降（P<0.05），推測(cè)當(dāng)PYM作用達(dá)到峰值后，未被抑制的細(xì)胞繼續(xù)增殖，消耗了更多的PYM，使單位細(xì)胞數(shù)的作用藥物減少，抑制作用隨之減弱。

表1 各濃度PYM作用于EA.hy926細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率（%）

2.2 PYM對(duì)EA.hy926細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 采用瑞氏-吉姆薩染色，相差顯微鏡下觀察PYM作用前、后EA.hy926細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示：在對(duì)照組，EA.hy926細(xì)胞呈多角形，核居中，絕大部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)呈典型的輔路石樣（見圖1）。在10、20μg/mL濃度下，PYM對(duì)EA.hy926細(xì)胞的作用主要表現(xiàn)為抑制，凋亡的形態(tài)學(xué)變化不明顯；40、80μg/mL的PYM處理24 h后，EA.hy926細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，如貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞由多角形變?yōu)闄E圓型或圓形、胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞核染色質(zhì)濃聚、邊緣化，形成環(huán)形核或新月形核、核碎裂、凋亡小體形成等（見圖2-3）。當(dāng)PYM濃度達(dá)160 μg/mL，則出現(xiàn)較多壞死細(xì)胞，細(xì)胞膜崩解，核碎裂，可見較多懸浮的細(xì)胞碎片。

2.3 PYM誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞早期凋亡、Caspase-3活化、線粒體膜電位下降的作用 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，PYM作用EA.hy926細(xì)胞24 h的細(xì)胞早期凋亡率、活化Caspase-3表達(dá)率及線粒體膜電位下降率在各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），隨藥物作用濃度增加而增高，見表2。

圖1 對(duì)照組EA.hy926細(xì)胞形態(tài)（×200）

圖2 40μg/mL PYM處理后EA.hy926細(xì)胞形態(tài)（×200）

圖3 80μg/mL PYM處理后EA.hy926細(xì)胞形態(tài)（×200）

表2 PYM對(duì)EA.hy926細(xì)胞早期凋亡率、活化Caspase-3表達(dá)率及線粒體膜電位下降率的影響（±s，%）

表2 PYM對(duì)EA.hy926細(xì)胞早期凋亡率、活化Caspase-3表達(dá)率及線粒體膜電位下降率的影響（±s，%）

組別 早期凋亡率 活化Caspase-3表達(dá)率 線粒體膜電位下降率對(duì)照組 4.50±0.36 0.39±0.03 7.56±0.49 10μg/mL 14.24±0.27 6.60±0.38 28.30±0.38 20μg/mL 20.83±0.60 11.58±0.54 29.72±0.34 40μg/mL 24.39±0.34 13.24±0.14 34.72±0.34 80μg/mL 27.15±0.28 18.95±0.28 37.21±0.32 160μg/mL28.48±0.47 20.89±0.26 54.24±1.31

2.4 PYM對(duì)EA.hy926細(xì)胞Caspase-8、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響 不同濃度（0、20、40、80）μg/mL PYM作用EA.hy926細(xì)胞24 h后，Caspase-8、Caspase-9蛋白原始帶隨PYM濃度的增加明顯下調(diào)，而激活帶明顯上升，對(duì)應(yīng)的內(nèi)參GAPDH則無明顯變化，見圖4。

3 討論

圖4 PYM對(duì)EA.hy926細(xì)胞的Caspase-8、Caspase-9表達(dá)的影響

多項(xiàng)研究已發(fā)現(xiàn)，PYM作為一種國產(chǎn)抗腫瘤抗生素，可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞株發(fā)生凋亡[7-10]，亦有文獻(xiàn)報(bào)道了PYM可引起脾竇內(nèi)皮細(xì)胞[11]、血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞[12]及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[4-5]凋亡，顯示了其用于治療血管瘤和血管畸形的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本研究以2.5～320μg/mL的PYM處理EA.hy926細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能有效地抑制細(xì)胞增殖且呈濃度時(shí)間依賴性；形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，PYM作用細(xì)胞后出現(xiàn)了典型的凋亡征象，如染色質(zhì)濃聚、斷裂、胞質(zhì)空泡化、凋亡小體形成等。

目前認(rèn)為在細(xì)胞凋亡早期，胞漿膜磷脂的不對(duì)稱性喪失，使膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸（PS）暴露于外層，可被對(duì)PS特異的AnnexinV探針?biāo)鶚?biāo)記。PS轉(zhuǎn)位亦可發(fā)生于晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，但早期凋亡細(xì)胞胞膜完整，而晚期凋亡和壞死細(xì)胞胞膜完整性被破壞，PI可對(duì)胞膜完整性被破壞的細(xì)胞染色而對(duì)胞膜完整細(xì)胞拒染，故AnnexinV結(jié)合PI行雙染色時(shí)，正?；罴?xì)胞不被染色，凋亡細(xì)胞可被AnnexinV標(biāo)記。本研究通過AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)到PYM處理EA.hy926細(xì)胞后存在PS由細(xì)胞膜內(nèi)向膜外的轉(zhuǎn)位,提示，PYM對(duì)EA.hy926細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用可能是通過凋亡介導(dǎo)的，一定藥物作用時(shí)間下的凋亡水平隨藥物濃度的增加而增高。

線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的早期事件，為凋亡的特征性改變。有研究[13]顯示，線粒體膜電位的下降或消失反映了線粒體內(nèi)膜的通透性增加，內(nèi)膜通透性的增加使僅在線粒體內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞色素C蛋白釋放到胞漿，繼而發(fā)生核的凋亡改變。本實(shí)驗(yàn)通過羅丹明123染色檢測(cè)到了PYM作用于EA.hy926細(xì)胞24 h線粒體膜電位在各濃度組呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，提示PYM可影響EA.hy926細(xì)胞的線粒體膜電位進(jìn)而通過激活線粒體途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

業(yè)已證實(shí)，Caspase家族引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡過程的中心環(huán)節(jié)。來自線粒體、細(xì)胞表面受體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的凋亡誘導(dǎo)信號(hào)促發(fā)了Caspase級(jí)聯(lián)反映，而這一級(jí)聯(lián)信號(hào)通路被歸結(jié)為線粒體途徑（內(nèi)源性途徑）、死亡受體途徑（外源性途徑）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。線粒體途徑受細(xì)胞色素C的調(diào)節(jié)。Bcl-2家族蛋白等凋亡相關(guān)蛋白作用于線粒體，使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿，胞漿的細(xì)胞色素C在dATP存在的條件下結(jié)合凋亡激活因子1（Apaf-1）、procaspase-9，形成凋亡小體，并促使procaspase-9發(fā)生自我催化，被激活的Caspase-9從復(fù)合體上釋放出來作為始動(dòng)子去激活下游的Caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14-15]。死亡受體途徑始于Fas等細(xì)胞表面受體，F(xiàn)as和配體Fasl結(jié)合后，吸引胞漿中死亡信號(hào)轉(zhuǎn)錄中的一個(gè)連接蛋白FADD，該蛋白又通過與procaspase-8的結(jié)合，共同形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC)，DISC的行成可誘導(dǎo)procaspase-8自身激活，活化的Caspase-8則進(jìn)一步激活下游的Caspase-3誘導(dǎo)凋亡[16]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)及Western-blot法檢測(cè)，結(jié)果顯示PYM作用于EA.hy926細(xì)胞后可引起Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活化蛋白水平明顯增加。周衛(wèi)兵等[5]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度PYM作用臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系24 h后，可上調(diào) Fas蛋白表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。因此認(rèn)為，PYM作用于EA.hy926細(xì)胞可能通過線粒體途徑和死亡受體途徑這兩條凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。該研究為目前臨床上PYM用于血管瘤的治療及促進(jìn)其進(jìn)一步的推廣提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)于我們開發(fā)PYM新的劑型，使其治療血管瘤更加微創(chuàng)、更具有靶向性具有重要意義。

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