王素云，王海蕓，黃曉燕，王本極，陳必成，潘嘉林，楊德業(yè)

（1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，溫州醫(yī)學(xué)院 心血管生物和基因研究所，浙江 溫州 325000；2.溫州市第三人民醫(yī)院 藥劑科，浙江 溫州 325000；3.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 外科實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325000）

急性心肌梗死（AMI）是心肌缺血性壞死，屬冠心病的嚴(yán)重類型。過去認(rèn)為壞死是心肌梗死的特征，近年來，越來越多的研究表明凋亡是梗死早期心肌死亡的主要方式[1]。心肌細(xì)胞凋亡已經(jīng)被認(rèn)為是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制以及治療心血管疾病的潛在靶點(diǎn)[2]。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）是腫瘤壞死因子超家族（TNFSF）成員[3]。有研究表明在冠心病患者的血清中TRAIL的表達(dá)下調(diào)[4]，AMI患者循環(huán)中CD3+和CD14+細(xì)胞表面mTRAIL的表達(dá)增加[5]。另有研究表明，TRAIL有抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化的活性[6-8]。這些均表明TRAIL可能是心血管疾病的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子。

本研究通過觀察阿托伐他汀干預(yù)缺血心肌TRAIL的表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡情況，探討阿托伐他汀對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的作用及可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 阿托伐他?。ㄝx瑞公司贈(zèng)送），細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（In Situ Cell Death Detection Kit，POD）購自Roche公司，兔抗鼠Bcl-2及Bax多克隆抗體均購自北京中杉金橋，兔抗鼠TRAIL多克隆抗體購自abcam，SP檢測試劑盒購自北京中杉金橋（pv-6001），HX-300動(dòng)物人工呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Sprague-Dawley大鼠，60只，體質(zhì)量250～300 g，購自上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005]。飼養(yǎng)于溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心普通級(jí)。

1.3 大鼠心肌梗死模型的復(fù)制 模型的復(fù)制參照文獻(xiàn)[9]。10%的水合氯醛（350 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠，以小動(dòng)物呼吸機(jī)機(jī)械通氣，頻率為70次/min，呼吸比3:2，潮氣量5～8 mL。于3或4肋間剪一2 cm橫切口，鈍性分離胸大肌和前鋸肌，剪開肋間肌及胸膜暴露心臟，采用左前降支結(jié)扎的方法建立大鼠心肌梗死模型，以II導(dǎo)聯(lián)心電圖上見ST段明顯抬高，同時(shí)梗死區(qū)心肌顏色變白，室壁運(yùn)動(dòng)明顯減弱為手術(shù)成功的標(biāo)志。

1.4 分組 術(shù)后24 h存活大鼠隨機(jī)分為心梗組和阿托伐他汀組。阿托伐他汀組予以阿托伐他汀10 mg·kg-1·d-1溶于2 mL 0.9%氯化鈉溶液中，灌胃給藥治療2周。假手術(shù)組開胸后只穿線不結(jié)扎。兩組均予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.5 血脂水平測定 各組大鼠手術(shù)處理前在乙醚麻醉下眼眶采血約1 mL，采血前禁食12 h以上。給藥2周后，禁食12 h以上，10%水合氯醛腹腔麻醉，開胸心臟采血約2 mL。所采血液靜置30 min，3000 r/min離心20 min，分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度膽固醇（HDL-C）和低密度膽固醇（LDL-C）含量。

1.6 心肌組織病理學(xué)分析 各實(shí)驗(yàn)組心肌組織經(jīng)甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm 切片，常規(guī)HE染色后，光鏡下觀察。心梗面積=左室梗死區(qū)周徑/[（左室心內(nèi)膜周徑+左室心外膜周徑）/2] ×100%。

1.7 TUNEL分析 按常規(guī)病理組織學(xué)方法制備心肌石蠟標(biāo)本。改良TUNEL方法[10]以Dnase I處理的組織作陽性對(duì)照，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。TUNEL陽性反應(yīng)為核呈棕褐色或棕黃色顆粒，被判定為凋亡細(xì)胞。400倍顯微鏡下在非缺血區(qū)心肌隨機(jī)取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。凋亡指數(shù)（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 Bcl-2、Bax、TRAIL的免疫組織化學(xué)檢測 采用SP兩步法: 滴加一抗Bcl-2 1:100，Bax 1:100，TRAIL 1:20 4 ℃過夜。以山羊抗兔二抗（北京中杉）孵育30 min。DAB顯色。蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。結(jié)果評(píng)價(jià)：Bcl-2和Bax陽性細(xì)胞均為胞漿著色，呈棕黃色顆粒；TRAIL陽性細(xì)胞為胞漿和胞膜著色，呈淺黃、棕黃色。400倍顯微鏡下在非缺血區(qū)心肌選取5個(gè)不重疊的陽性視野，用Image J圖像分析儀進(jìn)行分析，測定細(xì)胞陽性染色的平均光密度（OD值）與陽性細(xì)胞百分比，計(jì)算蛋白陽性表達(dá)指數(shù)（PEI）。PEI=OD值×陽性細(xì)胞百分比×100。同時(shí)計(jì)算Bcl-2與Bax的比值。TRAIL用平均光密度表示其相對(duì)表達(dá)量。

3.2 利用CaCO3透明圈法可以篩選出產(chǎn)酸菌，然后再結(jié)合革蘭氏染色以及代謝產(chǎn)物分析可以初步確定分離所得菌株為乳酸菌，但要確定其種屬還要進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。

1.9 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR 各組大鼠3只，心臟組織總RNA由TRIzol法提取。經(jīng)紫外吸收測定和變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量后，按RevertAidTM First Strand cDNA Synthe-sis Kit RT試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，用TRAIL、Bax、Bcl-2實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物（由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成）進(jìn)行熒光定量PCR檢測，GAPDH作為內(nèi)部參照。TRAIL引物序列為上游：5’-CCGATCCCATACTGCTG ATGA-3’，下游：5’-TTTGAGCTCGAACAGCCCC-3’；Bax上游：5’-AGCGGCTGCTTGTCTGGAT-3’，下游：5’- TG AGGACTCCAGCCACAAAGA-3’；Bcl-2上游：5’- TTCTCTC GTCGCTACCGTCG-3’，下游：5’- CCCTGAAGAGTTCCTCCA CCA-3’；GAPDH上游：5’-TCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3’，下游：5’-AGTGGCAGTGATGGCATGGACT-3’。用ABI 7500 FAST型熒光定量PCR 儀檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。通過比較ΔΔCt的方法進(jìn)行TRAIL、Bax、Bcl-2表達(dá)的定量分析，相對(duì)表達(dá)量用2－ΔΔCt表示。Ct為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔCt為TRAIL、Bax、Bcl-2 Ct值與內(nèi)參GAPDH Ct值之差，ΔΔCt為TRAIL、Bax、Bcl-2 ΔCt與假手術(shù)組ΔCt均值的差值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均采用±s描述，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 光鏡下觀察，假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，未見變性及壞死；模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，心肌細(xì)胞溶解性壞死，間質(zhì)增生，并有炎性細(xì)胞浸潤（見圖1）。除假手術(shù)組外，心肌梗死面積<30%的予以剔除，結(jié)果，假手術(shù)組大鼠6只，心梗組和阿托伐他汀組各8只被納入統(tǒng)計(jì)。

圖1 大鼠心肌HE染色（×10）

2.2 各組大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的變化各組大鼠治療后與治療前TC、TG、HDL-C、LDL-C水平相比，無明顯變化（P>0.05），表明阿托伐他汀在心肌梗死中發(fā)揮的治療作用與其降脂作用無明顯關(guān)系（見表1）。

2.3 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡 假手術(shù)組中偶見凋亡心肌細(xì)胞，心梗組可見大量胞核呈深淺不一棕褐色的凋亡心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，與假手術(shù)組相比，心梗組顯著升高（P<0.01）；與心梗組相比，阿托伐他汀組顯著下降（P<0.01）。阿托伐他汀干預(yù)心肌缺血大鼠能明顯減少其心肌細(xì)胞的凋亡（見表2、圖2）。

圖2 TUNEL法檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡（×400）

2.4 Bcl-2、Bax、TRAIL蛋白表達(dá) Bcl-2各組之間的相對(duì)表達(dá)量，阿托伐他汀組>心梗組>假手術(shù)組。各組組間比較，與假手術(shù)組相比，心梗組明顯升高（P<0.05），阿托伐他汀組顯著升高（P<0.01），與心梗組比，阿托伐他汀組明顯升高（P<0.05），表明阿托伐他汀干預(yù)心肌缺血大鼠能升高Bcl-2的表達(dá)（見表2）。

Bax在各組間均有表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

與假手術(shù)組和心梗組相比，阿托伐他汀組Bcl-2與Bax的比值明顯升高（P<0.05），而心梗組與假手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明阿托伐他汀干預(yù)心肌缺血大鼠能升高Bcl-2與Bax的比值（見表2）。

與假手術(shù)組相比，心梗組TRAIL表達(dá)顯著下降（P<0.01），阿托伐他汀組與心梗組相比表達(dá)顯著升高（P<0.01），表明阿托伐他汀干預(yù)心肌缺血大鼠能上調(diào)TRAIL表達(dá)（見表2）。

2.5 定量RT-PCR結(jié)果 與假手術(shù)組相比，心梗組TRAIL mRNA表達(dá)顯著下降（P<0.01），與心梗組相比，阿托伐他汀組TRAIL mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01），表明阿托伐他汀干預(yù)心肌缺血大鼠能上調(diào)TRAIL mRNA表達(dá)。假手術(shù)組與心梗組Bcl-2 mRNA表達(dá)無明顯差異，與心梗組比較，阿托伐他汀組Bcl-2 mRNA表達(dá)升高（P<0.05），表明阿托伐他汀干預(yù)心肌缺血大鼠能上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)。

與假手術(shù)組相比，心梗組及阿托伐他汀組Bax mRNA表達(dá)均升高，與心梗組比較，阿托伐他汀組下降（P<0.05），表明阿托伐他汀干預(yù)心肌缺血大鼠能下調(diào)Bax mRNA表達(dá)。與假手術(shù)組相比，心梗組Bcl-2/Bax顯著下降（P<0.01），與心梗組比較，阿托伐他汀組Bcl-2/Bax升高（P<0.05），表明阿托伐他汀干預(yù)心肌缺血大鼠能上調(diào)Bcl-2/Bax的值（見表 3）。

3 討論

阿托伐他汀屬他汀類降脂藥物，是一種3-羧-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA，HMG-COA）抑制劑。他汀類藥物能顯著降低TC、TG的合成。最近研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物能發(fā)揮獨(dú)立于降脂外的效應(yīng)。他汀類藥物能恢復(fù)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的功能，恢復(fù)血流[11-12]。在急性冠脈綜合征患者中，他汀類藥物具有穩(wěn)定粥樣斑塊、抗炎及減少心肌梗死和中風(fēng)概率的作用[13]。研究表明，他汀類藥物在經(jīng)皮冠脈介入術(shù)、冠脈搭橋術(shù)中起到保護(hù)心肌，減小心肌梗死面積的作用[14]。Tanaka等[15]觀察到阿托伐他汀能阻斷PKC抑制劑誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡。Ogata等[16]比較氟伐他汀與普伐他汀對(duì)培養(yǎng)鼠心肌細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)氟伐他汀呈時(shí)間及劑量依賴性誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，普伐他汀則無此作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀能顯著減少心肌梗死邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax及最終上調(diào)Bcl-2/Bax的比值有關(guān)。

表1 各組大鼠血脂水平比較（n=5，±s，mmol/L）

表1 各組大鼠血脂水平比較（n=5，±s，mmol/L）

組別假手術(shù)組心梗組阿托伐他汀組TC 1.91±0.18 1.63±0.10 1.98±0.26術(shù)前術(shù)后2周TG 0.42±0.26 0.47±0.26 0.73±0.24 HDL-C 0.67±0.06 0.57±0.03 0.73±0.14 LDL-C 0.38±0.10 0.19±0.02 0.31±0.05 TC 1.46±0.17 1.17±0.09 1.27±0.19 TG 0.41±0.34 0.21±0.10 0.16±0.06 HDL-C 0.55±0.03 0.45±0.02 0.42±0.10 LDL-C 0.24±0.053 0.29±0.05 0.29±0.06

表2 各組Bcl-2、Bax、TRAIL蛋白表達(dá)及凋亡指數(shù)比較（±s）

表2 各組Bcl-2、Bax、TRAIL蛋白表達(dá)及凋亡指數(shù)比較（±s）

與假手組比：aP<0.05，bP<0.01；與心梗組比：cP<0.05，dP<0.01

TRAIL（n=5）3.08+0.56 1.47+0.38b 3.85+0.31d組別假手術(shù)組心梗組阿托伐他汀組Bcl-2（n=6）11.50±8.80 50.50±13.74a 89.31±18.87bc Bax（n=6）23.12±11.53 91.43±46.76 57.78±44.86 Bcl-2/Bax 0.43±0.28 0.59±0.15 2.03±0.95ac凋亡指數(shù)（n=5）6.33±5.15 64.15±1.87b 26.33±8.18d

表3 TRAIL、Bcl-2、Bax基因定量RT-PCR結(jié)果（n=6±s）

表3 TRAIL、Bcl-2、Bax基因定量RT-PCR結(jié)果（n=6±s）

與假手術(shù)組比：aP<0.05，bP<0.01；與心梗組比：cP<0.05，dP<0.01

Bcl-2/Bax 0.63±0.37 0.16±0.06b 0.47±0.19c組別假手術(shù)組心梗組阿托伐他汀組TRAIL 1.03±0.28 0.36±0.23b 0.80±0.34d Bcl-2 0.23±0.12 0.15±0.03 0.33±0.11c Bax 0.38±0.05 1.01±0.45b 0.72±0.08ac

TRAIL屬II型跨膜蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)5種TRAIL受體，包括兩種死亡受體DR4、DR5，兩種誘騙受體DcR1、DcR2和一種可溶型受體OPG，均屬TNFSF成員。TRAIL與受體DR4、DR5結(jié)合可以通過依賴線粒體和非依賴線粒體兩條途徑發(fā)揮促凋亡的作用，而與DcR1、DcR2結(jié)合可以保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生凋亡。

文獻(xiàn)報(bào)道，正常心臟組織中發(fā)現(xiàn)有TRAIL及其受體的表達(dá)，其中DR5的表達(dá)水平很高[17]。Nakajima等[18]用免疫組化法發(fā)現(xiàn)在AMI患者的病理組織中，變性的心肌細(xì)胞有DR4和DR5的表達(dá)，提示TRAIL及其受體可能參與某些病理狀態(tài)下的細(xì)胞凋亡。但Secchiero等[19]認(rèn)為，在心血管系統(tǒng)，TRAIL只在特定的情況下誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，比如抑制Akt通路。有研究發(fā)現(xiàn)，在冠心病患者的血清中TRAIL的表達(dá)下調(diào)[4]；另有研究發(fā)現(xiàn)，AMI后早期血清TRAIL表達(dá)顯著下降，隨后逐漸升高，6～12個(gè)月恢復(fù)到接近健康水平，早期心肌梗死血清TRAIL的表達(dá)下降水平與心血管事件的發(fā)生密切相關(guān)，與負(fù)性預(yù)測指標(biāo)如CK、CK-MB、BNP呈負(fù)相關(guān)，因此，循環(huán)中的TRAIL在冠心病患者中可能起到保護(hù)作用[17]。最近的研究也證實(shí)，TRAIL及其受體（DR4和DR5）能促進(jìn)多種細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的存活和增殖[20-22]?，F(xiàn)在被廣泛接受的觀點(diǎn)是，TRAIL與受體DR4、DR5的結(jié)合能激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，繼而激活抗凋亡基因包括CIAP1、CIAP2、XIAP、TRAF1、TRAF2、c-FLIP和Bcl-XL。TRAIL與DR4和DR5結(jié)合也可以激活參與細(xì)胞存活過程的ERK1/2、MAPK、JNK和Akt[23]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，就蛋白質(zhì)水平及基因水平，急性心肌梗死后心肌TRAIL表達(dá)較假手術(shù)組均明顯下降，阿托伐他汀組缺血心肌TRAIL表達(dá)明顯升高，由此，我們推測，阿托伐他汀干預(yù)缺血心肌TRAIL表達(dá)上調(diào)可能參與了心血管的保護(hù)作用，這種作用可能與TRAIL的抗凋亡作用有關(guān)，而這種抗凋亡作用一部分可能與Bcl-2的高表達(dá)、抑制線粒體凋亡通路有關(guān)。

TRAIL基因在腫瘤的研究中較多，而在心血管領(lǐng)域的研究有限，我們的發(fā)現(xiàn)，結(jié)合前人的研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL除了促進(jìn)凋亡的作用，同時(shí)也有抗凋亡的作用，如何平衡其在兩者中的作用，以發(fā)揮對(duì)疾病的治療作用，具有一定的研究價(jià)值。阿托伐他汀是治療心肌缺血的常用藥物，其除了降脂作用外，還有多種作用，我們發(fā)現(xiàn)其改變了心肌TRAIL因子的表達(dá)，從而通過某種機(jī)制參與了抗凋亡作用。

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