曠文安，黃偉聰，王玨，楊凱，鄭哲，孫成超

（1.溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 心胸外科，浙江 溫州 325000；2.北京阜外心血管病醫(yī)院 衛(wèi)生部再生醫(yī)學重點實驗室，北京 100037）

最新的實驗研究表明，哺乳動物心臟在出生后早期存在心肌細胞的分裂增殖[1]，而對于成熟的心肌細胞，在特定的條件下仍然可以被誘導重新進入細胞周期，并以增生性生長為主的方式改善心臟功能[2]。心肌細胞的增殖依賴于心肌細胞的有絲分裂，Ccnd1、Ccna2、Ccnb1、Cdc2、CDk2、Cdk4、Cdkn1a和Cdkn1b等細胞周期進程相關基因的表達與心肌細胞的有絲分裂密切相關[3-4]。組蛋白H3的磷酸化貫穿于有絲分裂分裂期（M期）的各個時相[5]，是目前標記細胞有絲分裂的最佳指標之一，且廣泛用于心肌細胞的增殖研究中[1，6]。本實驗應用RT-PCR的方法定量檢測細胞周期相關基因在大鼠出生后早期不同時間點的表達情況，并以磷酸化組蛋白3（H3p）和肌鈣蛋白T（cTnt）雙重免疫熒光染色各時間點的心室肌組織，檢測其有絲分裂指數(shù)，在細胞和組織水平共同研究大鼠出生后早期心肌細胞的增殖情況。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 出生后第1、4、7、10、14天的SD大鼠由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供，研究經溫州醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、PBS、青鏈雙抗、胰蛋白酶（北京四環(huán)生物有限公司），胎牛血清FBS（美國Gibco公司），H3p小鼠IgG單克隆抗體（美國millipore公司），cTnt抗體（英國Abcam公司），DAPI染色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司），逆轉錄試劑盒PromegaA3500（美國Promega公司），引物設計與合成（北京六合通生物技術公司）：Gapdh（F：5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，R：5’-ATGGTGG TGAAGACGCCAGTA-3’）；Ccnd1（F：5’-TACCGCACAACGCA CTTTC-3’，R：5’-AAGGGCTTCAATCTGTTCCTG-3’）；Ccna2（F：5’-GCCATCGCTTATTGCTGGAG-3’，R：5’-CTTTGAGGTAGGTCTGGTGAAGGTC-3’）；Ccnb1（F：5’-GGTGGAACTGGATGAGCCTGA-3’，R：5’-TGTTTCCATTGGGC TTGGAGA-3’）；Cdk1（F：5’-TCCCTGCAGGACTACAAGAA CAC-3’，R：5’-GATTCGTTTGGCTGGATCATAGAC-3’）；Cdk2（F：5’-CCTGCACCAGGACC TCAAGAA-3’，R：5’-CGGTGAGAATGGCAGAATGCTA-3’）；Cdk4（F：5’-TAAAGGGCCACCTCCGCAGC-3’，R：5’-AAAGGCAGCCCCTCT CCTCACT-3’）；Cdkn1a（F：5’-CACGGCTCAGTGGACCAG AA-3’，R：5’-ACTGGAGCTGCCTGAGGTAGGA-3’）；Cdkn1b（F：5’-CGAATGCTGGCACTGTGGA-3’，R：5’-CATTCAAT GGAGTCAGCGATATGTA-3’）。

1.3 主要儀器設備 細胞培養(yǎng)超凈臺GB-II（北京長城空氣凈化設備公司），CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），realtime-PCR儀7300（美國AB公司），熒光顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 原代心肌細胞分離與純化：無菌條件下開胸取出生后第1、4、7、10、14天的大鼠心臟，PBS沖洗殘留血漬，剪碎心室肌組織，約1 mm3，然后用事先配好的消化液（trypsin 0.080%，Nacl 0.801%，Kcl 0.030%，NaHCO30.035%，Glucose·H2O 0.099%，pH 7.4）消化約12～16次（37 ℃，8 min/次）。將消化的細胞懸液離心后，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)70 min后，收集細胞懸液再次離心后，加入含10% FBS和1% Brdu的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，離心收集心肌細胞并加入Trizol試劑，-80 ℃保存。

1.4.2 心肌細胞RNA提取及qRT-PCR定量檢測：收集大鼠的原代心肌細胞，Trizol法提取總RNA，Sbyegreen法逆轉錄cDNA后在realtime-PCR儀7300上行定量PCR，以GAPDH為內參，利用2-ΔΔCt方法計算不同時間點心肌細胞Ccnd1、Cdk1和Cdkn1a等基因的mRNA表達水平。

1.4.3 心室肌組織免疫熒光雙重染色：開胸取出生后第1、4、7、10、14天的大鼠心臟，PBS沖洗殘留血漬，10%的中性甲醛液固定，制備石蠟切片，脫蠟脫水后，孵育H3p抗體（1:100）、cTnt抗體（1:1000）及二抗顯色，DAPI顯示細胞核。

1.4.4 熒光顯微鏡觀察并拍照：應用Olympus BX61正置熒光顯微鏡，在400倍視野分別觀察激發(fā)波長480 nm下H3P的表達，紫外光區(qū)DAPI的細胞核染色，以及在激發(fā)波長560 nm處觀察cTnt的表達，通過分析軟件拍照，并將三者圖像通過3D疊加以確定三者共表達的細胞。每個時間點8張切片，每張切片隨機拍下10個視野。

1.4.5 細胞計數(shù)：ImageJ軟件計數(shù)每個400倍視野中H3P-cTnt-DAPI共表達細胞數(shù)與總心肌細胞數(shù)，二者的比值，即為心肌細胞的有絲分裂指數(shù)（mitotic index，MI）。

2 結果

2.1 大鼠出生后早期不同時間點的心肌細胞有絲分裂指數(shù) 通過對大鼠生后第1、4、7、10、14天心室肌組織H3P（綠色）-cTnt（紅色）-DAPI（藍色）的多重免疫熒光染色（見圖1），我們可以清晰分辨出心肌細胞的有絲分裂相。數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示（見圖2）：出生后第1、4、7、10天大鼠心室肌組織MI分別為1.884%±0.118%、2.744%±0.183%、1.025%±0.053%和0.086%±0.012%。出生后第4天時心肌細胞有絲分裂指數(shù)出現(xiàn)峰值，約為第1天時的1.5倍（P＜0.05），第10天時，有絲分裂指數(shù)急劇下降，僅為第4天時的0.03倍（P＜0.05），出生后第14天的大鼠心臟卻未發(fā)現(xiàn)有絲分裂的心肌細胞。

圖1 大鼠出生后不同時間點心肌組織的雙重免疫熒光染色（×400）

圖2 大鼠出生后第1、4、7、10、14天時心肌細胞有絲分裂指數(shù)

2.2 大鼠出生后不同時間點的心肌細胞周期相關基因的mRNA表達水平 qRT-PCR法檢測出生后第1、4、7、10、14天SD大鼠心肌細胞中細胞周期進程相關基因的mRNA表達水平，數(shù)據(jù)顯示：出生后第4天心肌細胞Ccnd1、Ccna2、Ccnb1、Cdk1、CDk2和Cdk4出現(xiàn)表達高峰，然而在出生后第10天的心肌細胞中表達急劇下降，出生后第14天表達水平更低，而Cdkn1a、Cdkn1b的表達水平隨著大鼠日齡的增加呈遞增趨勢（見圖3）。

3 討論

心肌細胞的分裂增殖源于有絲分裂的完成，H3p是目前研究心肌細胞有絲分裂增殖的最佳標志之一。通過對心肌細胞有絲分裂指數(shù)的檢測，我們發(fā)現(xiàn)大鼠出生后第4天時，細胞有絲分裂指數(shù)到達峰值，之后第10天時則急劇下降，直至第14天時檢測不到。綜上結果，我們認為出生后第4天和第10天是大鼠心肌細胞增殖的拐點。Soonpaa等[7]研究認為小鼠出生后4～6 d心肌細胞DNA的合成高峰與心肌細胞的雙核化一致，并推測此時只有心肌細胞核分裂而沒有胞質分裂。但最近Porrello等[1]研究卻發(fā)現(xiàn)小鼠在出生后7 d心肌細胞仍具有完成胞質分裂的增殖能力。這種差異的存在可能源于各自研究手段和研究水平的不同，同時提示我們：出生后第4天有絲分裂指數(shù)峰值的出現(xiàn)與大部分心肌細胞的雙核化和多核化有關，但也不能排除有小部分完成了之后的胞質分裂，真正實現(xiàn)了心肌細胞的分裂增殖。出生后第10天大鼠心室肌細胞有絲分裂趨于停滯，第14天檢測不到，說明出生第10天后，大鼠心肌細胞逐漸喪失了分裂增殖能力。

心肌細胞的有絲分裂過程可分為G0、G1、S、G2和M期。G0/G1和G2/M是有絲分裂能否順利進行的兩個重要檢查點。有實驗[8-10]證明Ccnd1、Ccna2、Ccnb1基因產物CyclinD1、CyclinA2、CyclinB1和Cdk1、Cdk2、Cdk4等是細胞有絲分裂G0/G1、G2/M檢查點時相轉換最為重要的促進因子，而Cdkn1a、Cdkn1b基因產物p21、p27則是該時相轉換的重要阻滯因子[4]。

圖3 大鼠出生后第1、4、7、10、14天時心肌細胞周期相關基因的mRNA表達水平

Cyclind1/Cdk4復合物通過磷酸化Rb蛋白，解除其對E2F的結合抑制，活化的E2F可激活下游與S期相關的DNA聚合酶II、胸苷激酶的表達[8]。CyclinA2/Cdk2可促進復制前復合物的形成，啟動DNA的合成，是S期進行的關鍵。CyclinB1/Cdk1活性的逐漸增強被證實是協(xié)調有絲分裂進程的關鍵[10]。實驗發(fā)現(xiàn)上述Cyclins/Cdks的mRNA表達水平呈現(xiàn)先上升后下降趨勢（見圖3），出生后第4天的大鼠心肌細胞Ccnd1、Ccna2、Ccnb1、Cdk1、Cdk2和Cdk4出現(xiàn)表達高峰，在出生后第10天表達迅速下降，第14天表達更低，這種表達趨勢的變化與心肌細胞有絲分裂指數(shù)變化趨勢基本一致。Li等[11]認為出生后第4天時細胞周期進程相關基因出現(xiàn)表達高峰與心肌細胞的多核化及肥大性生長有關。Tamamori等[12]研究認為Ccnd1及Cdk4的高水平表達與心肌細胞的增生性生長有關，而我們的實驗也顯示在大鼠出生后第4～7天的心肌細胞中Ccnd1及Cdk4的表達水平都比較高。

心肌細胞分裂增殖能力的喪失與Cdkn1a、Cdkn1b的表達升高相關[9]。Stefano等[13]發(fā)現(xiàn)敲除Cdkn1a、Cdkn1b基因可促進胞漿分裂的完成，實現(xiàn)心肌細胞的分裂增殖。Poolman等[4]認為Cdkn1a、Cdkn1b基因的表達是心肌細胞退去細胞周期，維持G0/G1和G2/M阻滯的關鍵所在。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，Cdkn1a、Cdkn1b的mRNA表達水平隨大鼠日齡的增加呈現(xiàn)上升趨勢，且在第14天時，表達尤為明顯。Cdkn1a、Cdkn1b表達水平的升高增強了對Cyclin/CDKs活性的抑制，從而導致心肌細胞退出細胞周期，阻礙心肌細胞增殖，這與Stefano[13]和Poolman等[4]的研究結果相吻合。

心肌細胞的增殖是個多基因、多水平、極其復雜的調控過程，細胞周期的退出和增殖能力的喪失必然伴隨著相關基因和蛋白表達的上調或下降。通過各種手段檢測并篩選這一過程中的決定性指標將有助于闡明心肌細胞退出細胞周期的調控機制，從而找到促進心肌細胞增殖的靶點，是我們今后研究的方向。

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