張琳琳 王建業(yè) 徐 勇 楊 闊 楊一歌 王濱有 楊 澤

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性最常見的與年齡相關(guān)的惡性腫瘤，主要發(fā)生在(75～79)歲老年人。在西方許多國家，PCa是男性最常見的惡性腫瘤。美國在對1975～2006年癌癥發(fā)病率進行統(tǒng)計后，估算2010年P(guān)Ca新發(fā)病例為217730例，占男性全身各部位腫瘤28%，位居第一，估計PCa的死亡人數(shù)為32505例，占所有腫瘤導(dǎo)致死亡的11%，僅次于肺癌，位居第二［1］。而我國PCa患病率過去一直較低，近年來隨著人口老齡化增加，生活水平及醫(yī)療診斷技術(shù)的提高，PCa患病率緩慢增長，1993年為1.71人/10萬，2000年為4.55人/10萬。PCa已位居我國男性泌尿、生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率的第3位，成為影響我國45歲以上男性生活質(zhì)量和預(yù)期壽命的重要疾病之一［2］。

但是，PCa的發(fā)病機制尚不清楚，家族史和雙生子研究表明，遺傳因素是PCa發(fā)生的一個重要危險因素［3～5］。年齡、種族和家族史是已經(jīng)確定的PCa主要危險因素。目前PCa特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)在 PCa篩查中的應(yīng)用引起眾多爭議［6］，因此，PCa的遺傳學研究有助于為PCa發(fā)病機制的研究提供數(shù)據(jù)和尋找中國人群特異性的PCa標記物。2007年以來，學者們已經(jīng)開展了多個國家和人群的PCa全基因組掃描和多群體的驗證，不斷闡明新的PCa相關(guān)基因［7，8］。但是，這些新的遺傳風險標記在中國人群中得到研究驗證的很少，有必要開展基于中國人的PCa相關(guān)基因研究，以便為臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用和進一步深入研究提供參考依據(jù)。2012年7月，我們對北京市民中PCa患者和正常對照者 8q24區(qū) rs6983561(C)、rs13252298(T)、rs12543663(T)和8q21 rs1512268(T)風險基因位點進行關(guān)聯(lián)分析，并分析PCa患者中基因型和表型(臨床、遺傳、膳食習慣、嗜好等)的關(guān)系。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象:PCa患者來自衛(wèi)生部北京醫(yī)院泌尿外科，共124例，年齡(51～86)歲，平均年齡73.90歲;PSA值為0.15 ～1000.0 以上 ng/ml，平均 35.45ng/ml，均經(jīng)組織病理學檢查確診。對照組138例，均篩自本院體檢中心的常規(guī)體檢人群，均為男性，無PCa和其他腫瘤家族史。PSA值為0～11.19ng/ml，平均 1.35ng/ml，并經(jīng)直腸指診和 B 超檢查排除PCa，年齡(66～88)歲，平均年齡70歲，與PCa組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。研究對象及程序經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.1.2 試劑:全基因組DNA提取試劑盒購自博爾誠(北京)科技有限公司;Taq DNA聚合酶和dNTP購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司;引物由生工生物(上海)有限公司合成;基因測序由華大基因公司完成;飽和熒光染料購自美國Idaho公司。

1.1.3 主要儀器:DNA定量分析儀為NANODROP2000C;凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio.Rad公司的Gel DOC-2000成像系統(tǒng)。離心機為美國Beckman公司的Allegra“21 R型離心機;PCR擴增儀為美國MJ公司的PTC.225型PCR儀;高分辨熔解曲線(high resolutionmelting，HRM)基因突變/基因分型檢測系統(tǒng)為美國Idaho公司的Lightscanner TMHR-I 96。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取及定量:按試劑盒說明書進行操作，樣本DNA放置4℃保存。

1.2.2 PCR反應(yīng):NCBI數(shù)據(jù)庫下載SNP位點所在DNA序列。rs6983561(C)、rs13252298(T)、rs1512268(T)和rs12543663(T)附近的基因序列，引物設(shè)計通過oligo 6.0軟件完成。rs6983561(C)上游引物5′-AGGAGAATTGCAAACT-3′，下游引物 5′-CCTTGATATGCAATTAGC-3′;rs13252298(T)上游引物 5′-CTTGCTGTCTTCTCAGATA-3′，下游引物5′-CACACTTGCCATTTAG-3′;rs1512268(T)上游引物5′-CCCAATGCAGATTGAGTTA-3′，下游引物 5′-GAAGCAAACCCTTTCTGTAGA-3′;rs12543663(T)上游引物 5′-GCCACCTCAATATGAATA-3′，下 游 引 物 5′-CCATCAGCTTTTTAGTTTC-3′。高溫內(nèi)參上游引物5′-GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGA-GGTGCGGAAGCGGAGGGGCGGG-3′，下游引物 5′CCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC-3′。寡核苷酸內(nèi)參末端用C3封閉，以阻止延伸反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系10μl，其中包含:DNA模板1μl，10 × PCR Buffer 1μl，10 mmol/L dNTP 0.2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，rs1465618 和 rs12621278 上 下 游 引 物(10pmol/μl)各 0.1μl，1X LC-green PLUS 飽和熒光染料1μl，寡核苷酸內(nèi)參0.2μl(高溫寡核苷酸內(nèi)參與低溫寡核苷酸內(nèi)參4個片段各0.05μl)，去離子水補充總體積至10 μl。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5分鐘后進入主循環(huán)，95℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸6秒，總共35個循環(huán)，完成后72℃延伸7分鐘。之后進行HRM分析之前的變性和復(fù)性處理，程序為:95℃ 30秒，25℃ 2分鐘，94℃ 30秒，24℃4分鐘。

1.2.3 HRM檢測:將擴增的PCR產(chǎn)物移入HRM專用96孔板內(nèi)，在Lightscanner TMHR-I 96上進行HRM分析:升溫至45℃時，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲線，98℃結(jié)束，用LightScanner Call IT軟件對采集后的曲線進行分析，判定基因型。

1.2.4 測序驗證:根據(jù)HRM分析的不同熔解曲線確定不同的基因型。從所得的不同基因型的樣本中分別隨機抽取5例樣本進行測序驗證。需測序樣本的DNA重新進行PCR擴增，測序引物，以rs6983561為例，上游引物5′-GAATTGCAAACTAATAGAACATATA-3′，下游引物 5′CATATCAAGGATATTTGGTATAATACA-3′，退火溫度62℃。PCR反應(yīng)體系 50μl:DNA 模板 5μl，10 × PCR Buffer 5μl，10 mmol/L dNTP 1μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl，去離子水補充總體積至 50 μl。PCR 反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5分鐘后進入主循環(huán)，95℃變性30秒，退火45秒，72℃延伸60秒，35個循環(huán)之后72℃延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察合格后，送華大基因公司進行測序驗證。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)。運用Hardyweinberg平衡 (Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)檢驗研究樣本的群體代表性;用OR值及其95%CI評價相對風險;計量數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用T檢驗;組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用Fisher和Pearson χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1 PCa候選基因關(guān)聯(lián)分析 通過GWAS和查閱相關(guān)文獻，本研究 確 定 rs6983561、rs13252298、rs1512268 和rs12543663為PCa患病風險的四個候選等位基因，并對四個 基因位點進行基因型和等位基因與PCa的關(guān)聯(lián)分析，見表1。

表18 q24 區(qū)(rs6983561，C)、(rs13252298，T)、(rs12543663，T)和8q21(rs1512268，T)基因型和等位基因與PCa的關(guān)聯(lián)分析

表 1 顯示，rs6983561、rs13252298、rs1512268 和 rs12543663在各對照組中的變異基因型均符合HWE(χ2＜1)，無顯著性偏 離。rs6983561，C、rs13252298，T、rs1512268，T 和rs12543663，T的風險等位基因頻率(risk allele frequency，RAF)在兩組間的分布差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。rs6983561、rs13252298、rs1512268 和 rs12543663 的風險基因及風險基因型均未檢測到與PCa的關(guān)聯(lián)。

2.2 PCa相關(guān)質(zhì)量表型 根據(jù)PCa患者的質(zhì)量性狀(表型)，包括患者的臨床特征、PSA、婚姻、膳食和教育程度等11類觀察指標。為了檢測PCa關(guān)聯(lián)基因型的遺傳模型，本研究采用了顯性和隱性兩種模型分析，見表2。

表2 112例PCa患者表型與4個基因型的關(guān)聯(lián)分析

表2 續(xù)表

表2顯示，在4個位點分類中，除了rs12543663的突變基因型與腫瘤分期有統(tǒng)計學意義(P=0.010)外，其他觀察指標與這四個位點的各基因型無關(guān)。

2.3 PCa相關(guān)數(shù)量表型與基因型的關(guān)聯(lián)分析 針對PCa患者的數(shù)量性狀(表型)，共計12個觀察指標，包括病程、PSA血清濃度等在3個基因型個體間分布的相應(yīng)數(shù)據(jù)，按4個風險等位基因型分組進行顯著性檢驗，見表3。

表3 PCa患者的臨床特征、身體特征、時間連續(xù)變量、吸煙、飲酒和食物攝取量在4個基因型個體間的分布()

表3 PCa患者的臨床特征、身體特征、時間連續(xù)變量、吸煙、飲酒和食物攝取量在4個基因型個體間的分布()

rs13252298 CC AA+AC P GG AG+GG P年齡(歲) 74.17 ±5.70 72.67 ±4.074 0.854 73.07 ±5.012 74.07 ±4.714 0.768*病程(年) 2.60 ±2.19 3.24 ±2.598 0.458 2.90 ±2.183 3.16 ±2.563 0.757 PSA(ng/ml) 2.86 ±0.378 2.55 ±0.608 0.086* 2.56 ±0.726 2.58 ±0.583 0.902起始煙齡(歲) 22.17 ±6.616 30.00 ±15.811 0.323 25.00 ±4.690 24.45 ±6.173 0.820吸煙年限(年) 12.50 ±6.124 13.11 ±8.953 0.829 26.2 ±14.498 28.87 ±16.002 0.725日吸煙量(支) 16.00 ±18.254 19.77 ±13.183 0.874 13.40 ±6.148 13.48 ±9.730 0.987戒煙年限(年) — 40.64±15.220 0.561 21.3±15.503 18.90±13.705 0.815起始飲酒年齡(歲) 30.00 33.56 ±12.681 0.029 43.33 ±7.572 33.64 ±20.427 0.228酒精度(%) 0 40.64 ±15.220 0.789 32.0 ±11.314 33.00 ±12.543 0.916飲酒年限(年) 40.00 30.96 ±13.681 0.536 27.00 31.73 ±13.44 0.738蛋類量(個) 1.00 ±0.00 1.20 ±0.447 0.533 1.20 ±0.447 1.19 ±0.441 0.959 BMI(kg/m2) 29.47 ±9.98 4.47 ±0.451 0.183*rs6983561指標23.941 ±3.99 25.042 ±5.303 0.417

表3 續(xù)表

表3顯示，PCa患者的數(shù)量性狀(表型)與12個觀察指標關(guān)系中，攜有rs1512268的GG風險基因型比攜有AG或AA基因型的PCa患者飲酒的酒精度數(shù)高，并有顯著性差異(P=0.01)。

2.4 連鎖不平衡分析 對位于同一條染色體上且距離＜500kb的三個位點用Haploview V.4.0軟件LD分析位點間的D′和 r2值，見表 4。從表 4可以看出，rs13252298與rs6983561兩個等位基因的連鎖作用與PCa有關(guān)(D′=0.676;r2=0.062)。合并病例和對照人群后對這三個點的連鎖情況進行作圖后推測，圖1;同時對3個風險等位基因的單體型AA、AC和GA在病例和對照人群中的分布頻率進行比較分析，見表5。表5顯示，單體型AA、AC和GA在病例和對照人群中無統(tǒng)計學差異。

表4 8q24區(qū)上3個位點間的D′和r2值

圖1 8q24上的4個點LD分析結(jié)果

表5 8q區(qū)上風險等位基因組成的單體型在病例對照人群中的關(guān)聯(lián)分析

3.討論

前列腺癌的發(fā)生原因很復(fù)雜，多項研究證明，其病因不僅與年齡、種族、家庭遺傳有關(guān)，而且膳食結(jié)構(gòu)、環(huán)境等非遺傳因素與前列腺癌發(fā)生均有密切關(guān)系。其中，遺傳和年齡因素是不變因素:絕大多數(shù)患者在45歲及以上發(fā)生，PCa患者的平均診斷年齡為70歲［6］。尸檢研究［7］揭示，50歲男性中PCa患者占30%，70歲男性約80%患有PCa;而本研究對于另一個不變因素——遺傳因素，即對PCa的部分相關(guān)基因位點進行聯(lián)合分析，同時觀察各自貢獻PCa發(fā)生風險的獨立作用。雖然每一基因均有多個SNP，但在遺傳病因?qū)W研究中，通常有證據(jù)(文獻報道和預(yù)實驗等)基礎(chǔ)上選擇候選基因，作為疾病關(guān)聯(lián)研究的策略之一，本組也采用了同樣的研究策略。本研究對8q24區(qū)上的3個SNPs和8q21區(qū)上1個SNP做了與PCa發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)分析。

盡管近來許多研究結(jié)果表明，由于8q24區(qū)對 MYC(一種致癌基因)基因具有編碼調(diào)控作用，所以8q24區(qū)與PCa發(fā)病具有密切關(guān)系［8］。但本研究結(jié)果卻顯示不同結(jié)果，候選的4個SNPs與北京市PCa患者均無關(guān)。

一項Meta分析表明，在同一類種族群體中，rs6983561與PCa十分顯著相關(guān)性［8］;在 Murphy AB［9］的研究結(jié)果中也表明SNPs rs6983561在西部非洲人人群中與PCa具有十分顯著相關(guān)性(P＜0.03)，但Murphy AB研究小組同時在加勒比海人群中進行同樣的實驗，卻顯示不同的結(jié)果，SNPs rs6983561與PCa沒有相關(guān)性，該研究將這一原因歸于種族的不同，所以本研究中出現(xiàn)這一結(jié)果的主要原因可能也與種族差異有關(guān)。在今后的研究中可以選擇中國其地區(qū)人群進一步驗證這一結(jié)果;Suzuki M［10］等在日本人群中對 rs6983561與PCa易感位點的研究結(jié)果表明，位于8q24區(qū)的 rs6983561與PCa的死因別生存(CSS)與總生存期(OS)有顯著相關(guān)性。攜有rs6983561CA/CC基因型的PCa患者生存期長與攜有rs6983561 AA基因型的PCa患者。而本研究雖然對rs6983561的CSS與OS未做相關(guān)分析，但與病程做了相關(guān)研究探討，結(jié)果沒有相關(guān)性，本研究可以考慮進一步對CSS、OS與病程進行三方面的比較研究。另外，臺灣人也有相關(guān)研究結(jié)果顯示，攜帶rs6983561(C)的患者與PCa具有顯著相關(guān)性，而且與PCa的惡化程度成正向相關(guān)性。另有一篇關(guān)于全基因組和復(fù)制研究的Meta分析［11］，其收集了21篇高質(zhì)量文章，在71個群體間對31個候選SNPs與PCa相關(guān)性做了比較研究，結(jié)果中仍然顯示rs6983561與PC具有顯著相關(guān)性。

rs12543663和rs13252298均位于8p24區(qū)。在目前文獻中沒有發(fā)現(xiàn)對這兩個基因位點與PCa相關(guān)性的報道。本實驗室劉明的課題中對rs12543663和rs13252298做了基因型以及單體型分析，結(jié)果表明rs12543663和rs13252298與PCa均無相關(guān)性，但是發(fā)現(xiàn)rs12543663突變基因型與腫瘤分期有統(tǒng)計學意義(p=0.010)，即攜有突變基因型 AA或 AC的rs12543663患者癌瘤直徑多數(shù)大于＞5cm，而攜有CC基因型患者的癌瘤直徑多＜5cm，可能說明rs12543663患者的腫瘤增長較其他基因型患者腫瘤增長的速度快;而rs13252298與rs1016343、rs6983561和rs16901966的haplotype的分析結(jié)果顯示，雖然獨立的rs13252298與PCa無關(guān)，但rs13252298與其他同條染色體上的rs6983561基因位點連鎖作用與PCa有相關(guān)性。

而rs1512268是位于前列腺抑制基因NKX3.1的8p21區(qū)的等位基因，Liu F，Hsing AW等［12］在中國人群中的研究結(jié)果表明，rs1512268與PCa的相關(guān)性達到了顯著性水平(P=9.39 × 10-4);近期，Shusuke Akamatsu［13］在他的研究中明確提出，rs1512268導(dǎo)致PCa的易感性的原因是由于同條染色體上離其較近的rs11781886的連鎖作用而引起的，rs11781886(C/T)是通過下調(diào)NKX3.1的表達，從而控制了NKX3.1這一抑癌基因的保護性作用而導(dǎo)致PCa的發(fā)生。而在本研究結(jié)果中卻顯示該等位基因與PCa發(fā)生無相關(guān)性，這可能與樣本量的大小及人群差異有關(guān)。但本研究中卻發(fā)現(xiàn)，rs1512268的GG基因攜帶者飲酒的酒精度顯著高于AG和AA基因攜帶者(P=0.012)。

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