趙明君，賈俊濤，陳吉祥，3＊＊

（1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與基因資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003；2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島266002；3.蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州730050）

副溶血弧菌一種糖蛋白酶（復(fù)蘇促進(jìn)因子）在大腸桿菌中的表達(dá)及性質(zhì)＊

趙明君1，賈俊濤2，陳吉祥1，3＊＊

（1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與基因資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003；2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島266002；3.蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州730050）

用PCR方法從副溶血弧菌8621.4基因組中擴(kuò)增出1種細(xì)胞復(fù)蘇促進(jìn)因子家族的糖蛋白酶（Glycoprotease，Gcp）基因，核酸序列分析表明其含有完整的gcp基因開放閱讀框，編碼233個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。核酸序列與副溶血弧菌糖蛋白酶家族基因的序列相似性為100%。其氨基酸序列與哈維氏弧菌HY01、弧菌Ex25、溶珊瑚弧菌、擬態(tài)弧菌和殺鮭弧菌LFI1238等糖蛋白酶的序列相似性為67%～92%。將該基因克隆到表達(dá)載體p ET28a，在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，用Ni瓊脂糖親和柱層析純化的蛋白為單一條帶，利用純化的Gcp免疫新西蘭大白兔制備特異性抗體，Western－Blotting分析發(fā)現(xiàn)正常生長(zhǎng)及活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC）誘導(dǎo)過程中的副溶血弧菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Gcp蛋白為1條帶，分子量約為27 k Da，而在VBNC狀態(tài)的菌體中檢測(cè)到2條蛋白帶。研究結(jié)果為進(jìn)一步探索海洋弧菌活VBNC的形成和復(fù)蘇機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

副溶血弧菌；復(fù)蘇促進(jìn)因子；糖蛋白酶；表達(dá)；性質(zhì)

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）廣泛分布于江湖河口及海洋環(huán)境，是引起魚、蝦等水產(chǎn)動(dòng)物疾病的條件性致病菌，也是引起人食物中毒的重要病原菌［1－2］。副溶血弧菌的致病因子有溶血素、脂多糖、胞外蛋白酶、尿素酶及Ⅲ型分泌系統(tǒng)等［3－5］。許多病原菌在不良環(huán)境中能形成活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（Viable but Nonculturable State，VBNC），VBNC狀態(tài)的細(xì)菌在一定條件下復(fù)蘇為可培養(yǎng)形式，并保持其致病性［6］。已發(fā)現(xiàn)大腸桿菌（Escherichia coli）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）等60多種細(xì)菌能形成活的非可培養(yǎng)狀態(tài)［7－9］，其中包括弧菌屬的許多細(xì)菌，如創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血弧菌等［10－14］，副溶血弧菌在低溫寡營(yíng)養(yǎng)條件下進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)后，采用升溫和添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能復(fù)蘇為可培養(yǎng)狀態(tài)［15］，但有關(guān)細(xì)菌復(fù)蘇的機(jī)制仍不清楚。

細(xì)胞復(fù)蘇促進(jìn)因子（Resuscitation－promoting factor，Rpf）是一類能夠有效促進(jìn)休眠期細(xì)菌復(fù)蘇的生長(zhǎng)因子。Mukamolova等最初將過濾的滕黃微球菌（Micrococcus luteus）培養(yǎng)上清液加到非可培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)菌中能促進(jìn)其恢復(fù)生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中有復(fù)蘇促進(jìn)因子存在［16］。隨后在許多高G＋C含量的革蘭氏陽性細(xì)菌，如分枝桿菌屬（Mycobacteria）、鏈霉菌屬（Strepto－mycetes）、棒桿菌屬（Cornebacteria）等中發(fā)現(xiàn)與Rpf功能類似的蛋白［17］?，F(xiàn)已報(bào)道的功能和基因序列相似的蛋白還包括結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteria tuberculosis）的Rpf［18］、腸沙門氏菌（Salmonella enterica）、溶血性巴斯德氏菌（Pasteurella haemolytica）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的糖蛋白酶（Glycoprotease，Gcp）［19－21］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的YabE［19］、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）的Rpf和YeaZ蛋白等［22－23］。有關(guān)弧菌細(xì)胞復(fù)蘇促進(jìn)因子家族蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究報(bào)道較少，本文擬對(duì)副溶血弧菌的Rpf家族的基因進(jìn)行克隆、表達(dá)、純化及性質(zhì)研究，以便進(jìn)一步探索海洋弧菌VBNC狀態(tài)的形成和復(fù)蘇機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）8621.4分離于食用海鮮而腹瀉的病人，經(jīng)API 20 E生理生化、Vitek 32系統(tǒng)及16S r DNA序列分析鑒定后由本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒p MD19－T購(gòu)自大連Ta KaRa公司，大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）購(gòu)自TIANGEN公司，質(zhì)粒p ET28a（＋）購(gòu)自Novagen公司。

1.2 主要試劑和儀器

Taq DNA聚合酶、d NTP、IPTG、各種限制性內(nèi)切酶、DL2000 DNA Marker和DNA凝膠回收純化試劑盒購(gòu)自大連Ta KaRa公司，Ni瓊脂糖親和層析柱購(gòu)自Novagen公司，硝酸纖維素（NC）膜購(gòu)自美國(guó)Bio－Rad公司，預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量購(gòu)自TIANGEN公司。辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。主要儀器包括PCR儀（BIORAD，Mexico），UV－2100 PC分光光度計(jì)（Unico），凝膠成像儀（BIO－BEST），MIKRO 22R離心機(jī)（Hittich，Germany）和電泳儀（BioRad）。

1.3 副溶血弧菌gcp基因克隆及序列分析

根據(jù)已發(fā)表的副溶血弧菌基因組序列及其他細(xì)菌復(fù)蘇促進(jìn)因子家族蛋白的基因序列進(jìn)行對(duì)比，設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物為：5’－CGCGAATTCATGAGCGCAAAAATTCTTGCTATCG－3’，含Eco RⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物為：5’－CGCCTCGAGTTATTCGCGGCCTGGAAGCTT－3’，含XhoⅠ酶切位點(diǎn)，引物由上海生物工程公司合成。

用酚－氯仿法提取副溶血弧菌基因組DNA，用50 μL PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性50 s，58℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；末次循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DNA凝膠回收試劑盒純化，回收片段連接p MD19－T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，重組質(zhì)粒命名為p MD19－T－gcp，由上海生物工程公司進(jìn)行序列測(cè)定，在NCBI（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／blast.cgi）進(jìn)行序列分析。

1.4 副溶血弧菌gcp基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及在大腸桿菌中表達(dá)

根據(jù)已克隆測(cè)序的副溶血弧菌gcp基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)引物：上游引物為：5’－CGCGAATTCATGAGCGCAAAAATTCTTGCTATCG－3’，起始于起始密碼子，引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ；下游引物為：5’－CGCCTCGAGTTCGCGGCCTGGAAGCTT－3’，引物終止于終止密碼子前（不包含終止密碼子），引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以重組克隆質(zhì)粒p MD19－T－gcp為模板，擴(kuò)增出gcp基因。PCR反應(yīng)條件如前。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a（＋）分別用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切。回收酶切的gcp基因片段和質(zhì)粒pET28a（＋），用T4－DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化至DH5α，挑取陽性克隆接種于5 mL含30μg／m L卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，PCR擴(kuò)增及EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定陽性克隆，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET28a－gcp。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）得到重組菌BL21－p ET28a－gcp。

將重組菌BL21－pET28a－gcp接種于5 mL含30μg／mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)后取50μL接種于5 mL相同的培養(yǎng)基，于37℃振蕩培養(yǎng)3 h，加入終濃度為0.8 mmol／L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，吸取1 m L菌液，12 000 r／min低溫離心20 min，分別收集菌體和上清液。在收集的菌體中加入生理鹽水、5×SDS－PAGE Loading buffer，混勻后100℃煮沸變性10 min，離心取上清后用SDS－PAGE（12%的分離膠和5%的濃縮膠）分析表達(dá)的蛋白。

1.5 Ni瓊脂糖柱親和層析純化表達(dá)的Gcp蛋白

將5 m L Ni瓊脂糖裝層析柱，用10 mmol／L咪唑洗滌緩沖液（20 mmol／L Tris－HCl，p H＝8.0，10 mmol／L咪唑，0.5 mmol／L NaCl）平衡。10 mmol／L咪唑洗滌緩沖液重懸收集的誘導(dǎo)表達(dá)菌體，在低溫環(huán)境中超聲破碎，12 000 r／min低溫離心10 min，上清液經(jīng)0.22μm濾器抽濾后上柱。分別用2倍體積的10 mmol／L咪唑洗滌緩沖液和10倍體積的20 mmol／L咪唑洗滌緩沖液（50 mmol／L Tris－HCl，p H＝8.0，20 mmol／L咪唑，0.5 mmol／L NaCl）洗滌。最后用150 mmol／L咪唑洗脫緩沖液（20 mmol／L Tris－HCl，p H＝8.0，150 mmol／L咪唑，0.5 mmol／L NaCl）洗脫，收集洗脫液。將洗脫液置于透析袋中4℃透析24 h得帶有His標(biāo)簽的表達(dá)蛋白。

1.6 Gcp特異性抗血清制備及檢測(cè)

體質(zhì)量2 000 g左右的新西蘭大白兔2只，正常飼養(yǎng)1周后，純化的Gcp與等量弗氏完全佐劑（FCA，Sigma）混合乳化，對(duì)新西蘭大白兔背部皮下多點(diǎn)注射，每只兔子注射抗原的劑量為0.8～1 mg，首次免疫21 d后，將Gcp與弗氏不完全佐劑混合乳化進(jìn)行第2次免疫，免疫劑量相同；免疫21 d后用相同劑量加強(qiáng)免疫1次，最后一次免疫7 d后通過心臟取血，將血清分裝于離心管中，保存于－70℃冰箱備用。免疫期間定期取血用ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)。

1.7 Western－Blotting檢測(cè)正常生長(zhǎng)副溶血弧菌gcp基因表達(dá)

取過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌8621.4 100μL，涂布于含無菌玻璃紙的2216E平板，于28℃培養(yǎng)24 h。無菌生理鹽水洗脫2216E平板上的菌體，12 000 r／min離心10 min。分別收集菌體和上清液，上清液于10 k Da超濾離心管濃縮，經(jīng)SDS－PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)至NC膜，用含0.2 g／L封閉蛋白的PBST 4℃封閉過夜；PBST搖床振蕩洗滌NC膜5 min，與稀釋的Gcp特異性抗體（1∶1 000）于37℃孵育2 h；PBST搖床振蕩洗滌NC膜3次，與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶400）于37℃孵育2 h；PBST搖床震蕩洗滌NC膜4次、每次5 min，DAB顯色1 min并觀察結(jié)果。

1.8 副溶血弧菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)過程中g(shù)cp基因表達(dá)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的副溶血弧菌8621.4接種于滅菌的過濾海水中，使其終濃度為107CFU／m L，靜置于4℃冰箱，并定期取樣進(jìn)行檢測(cè)。分別用吖啶橙染色熒光顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（AODC）、活菌直接計(jì)數(shù)法（DVC）和涂布平板法（PC）測(cè)定細(xì)菌總數(shù)、活細(xì)菌數(shù)和可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)［15］。當(dāng)可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)降到0時(shí)，再加大接種量，即每個(gè)平板接種1 mL，連續(xù)測(cè)定3 d可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)仍然為0時(shí)，即認(rèn)為實(shí)驗(yàn)水體中的細(xì)菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。

收集上述在自然海水中低溫條件下培養(yǎng)45 d和進(jìn)入VBNC狀態(tài)的副溶血弧菌8621.4菌懸液，12 000 r／min離心10 min。分別收集菌體，SDS－PAGE電泳，用上述Western－blotting方法分析。

2 結(jié)果

2.1 副溶血弧菌gcp基因克隆及序列分析

從副溶血弧菌8621.4基因組中擴(kuò)增出702 bp特異性片段，與預(yù)期大小一致（見圖1）。DNA序列分析表明含有g(shù)cp基因閱讀框，編碼233個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，沒有明顯的信號(hào)肽及跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域。BLAST結(jié)果顯示該基因序列與副溶血弧菌糖蛋白酶家族基因（BA000031.2、ACFM01000021.1、ACKB01000150.1、ACFO01000021.1、ACFN01000071.1）的序列相似性為100%。其氨基酸序列與哈維氏弧菌HY01（ZP 01988470.1）、副溶血弧菌16（ZP 05120599.1）和殺鮭弧菌LFI1238（YP 002262409.1）的糖蛋白酶的序列相似性分別為92%、75%和67%。與弧菌（Vibrio sp）Ex25（YP 003286719.1）、溶珊瑚弧菌ATCC BAA－450（ZP 05885243.1）和擬態(tài)弧菌VM223（ZP 06033833.1）M22肽酶的序列相似性分別為90%、79%和74%。與傷寒沙門氏菌LT2（NP 460776.1）、腸沙門氏菌（AAX08054.1）和大腸桿菌（ACG59770.1）的復(fù)蘇促進(jìn)因子的序列相似性為57%。與變形桿菌HI4320的復(fù)蘇促進(jìn)因子（糖蛋白酶，YP 002150897.1），魯氏耶爾森氏菌ATCC 29473（ZP 04616226.1）和克氏耶爾森氏菌ATCC 33638（ZP 04623921.1）M22肽酶YeaZ的序列相似性為55%。

圖1 副溶血弧菌8621.4 gcp基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR product of gcp gene obtained by amplification from V.parahaemolyticus 8621.4

將其氨基酸序列與上述不同種屬?gòu)?fù)蘇促進(jìn)因子及相似性蛋白的氨基酸序列通過Clustal（Clustalw multiple alignment）進(jìn)行多序列比對(duì)，采用MEGA3.1的鄰接法（Neighbor－joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。其結(jié)果見圖2。

圖2 副溶血弧菌Gcp的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on Gcp protein from V.parahaemolyticus 8621.4

2.2 副溶血弧菌gcp基因在大腸桿菌中的表達(dá)及純化

副溶血弧菌gcp基因克隆至原核表達(dá)載體p ET28a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21得到陽性表達(dá)菌株BL21－p ET28a－gcp。重組菌在含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，菌體裂解液經(jīng)Ni親和層析柱分離純化，進(jìn)行SDS－PAGE電泳可見有1條30 k Da的特異性表達(dá)蛋白帶，理論推測(cè)值為26.98 k Da，培養(yǎng)上清液中未檢測(cè)到特異性表達(dá)蛋白（見圖3）。

圖3 重組菌BL21－p ET28a－gcp表達(dá)蛋白的SDS－PAGEFig.3 SDS－PAGE analysis of Gcp expressed in E.coli M.Protein molecular weight marker

圖4 Western－blotting分析不同生長(zhǎng)狀態(tài)下副溶血弧菌gcp基因表達(dá)Fig.4 Western－blotting analysis of gene from V.parahaemolyticus 8621.4 in different cultural conditions

2.3 副溶血弧菌在不同生長(zhǎng)狀態(tài)下gcp基因的表達(dá)

由BL21－p ET－28a－gcp表達(dá)及純化的Gcp免疫新西蘭大白兔后制備抗血清，ELISA法檢測(cè)制備的Gcp抗血清效價(jià)為1∶1 024 000，Western－blotting結(jié)果顯示該抗血清能與Gcp蛋白很好的反應(yīng)。

分別收集正常生長(zhǎng)狀態(tài)、低溫條件下培養(yǎng)45 d和進(jìn)入VBNC狀態(tài)的副溶血弧菌8621.4菌懸液，12 000 r／min離心10 min收集菌體，SDS－PAGE電泳后，進(jìn)行Western－blotting，結(jié)果表明正常培養(yǎng)和低溫培養(yǎng)45 d的副溶血弧菌8621.4菌體中表達(dá)Gcp，分子量為27 k Da，VBNC狀態(tài)的菌體中出現(xiàn)2條蛋白帶，分子量為27和54 k Da（見圖4），而在培養(yǎng)上清中沒有發(fā)現(xiàn)特異性表達(dá)的蛋白帶。

3 討論

微生物可以通過改變自身生理代謝和基因表達(dá)調(diào)控以適應(yīng)不良環(huán)境，活的非可培養(yǎng)狀態(tài)是細(xì)菌對(duì)不良環(huán)境的一種適應(yīng)，當(dāng)條件適宜時(shí)又恢復(fù)為可培養(yǎng)形式。不同病原菌在這一過程中的基因表達(dá)和生理代謝有一定差異。具有細(xì)胞復(fù)蘇作用和促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)的因子最初在藤黃微球菌中發(fā)現(xiàn)，微量的Rpf能有效促進(jìn)休眠的微球菌以及非生長(zhǎng)細(xì)菌的復(fù)蘇和生長(zhǎng)，藤黃微球菌Rpf蛋白具有胞壁溶解活性和胰蛋白酶樣活性，當(dāng)重組表達(dá)的蛋白分泌到大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中時(shí)能夠引起細(xì)胞裂解，Rpf蛋白能水解人工合成的溶菌酶底物和藤黃微球菌細(xì)胞壁粗提物，其氨基酸序列中第54位谷氨酸突變后水解肽聚糖的活性降低［24］，rpf基因敲除后藤黃微球菌無法生長(zhǎng)［25］。目前結(jié)核分枝桿菌的Rpf樣蛋白研究較多，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Rpf A－E 5種功能相似的Rpf樣蛋白，其中Rpf A和Rpf D被認(rèn)為是分泌到細(xì)胞外的，其余3種則被認(rèn)為附著在細(xì)胞表面［26］。同時(shí)敲除rpf A－rpf B－rpf C或rpf A－rpf C－rpf D 3個(gè)基因后細(xì)菌生長(zhǎng)受到明顯抑制。敲除其中任意1個(gè)基因或同時(shí)敲除rpf B－rpf C－rpf D 3個(gè)基因?qū)?xì)菌存活和生長(zhǎng)沒有顯著影響［27－28］，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Rpf B是結(jié)核分枝桿菌唯一和必需的復(fù)蘇促進(jìn)因子［29］。利用酵母雙雜交印跡發(fā)現(xiàn)了1種能夠與結(jié)核分枝桿菌RpfB結(jié)合的伴侶蛋白分子，稱作Rpf結(jié)合蛋白A（Rpf－interacting protein A，Rip A），是1種與細(xì)胞膜結(jié)合的分泌蛋白，具有肽聚糖水解活性，100 pmol／L的Rip A蛋白即可顯著促進(jìn)休眠的恥垢分枝桿菌復(fù)蘇和生長(zhǎng)［30］。熒光顯微檢測(cè)RpfB和Rip A定位在分裂期結(jié)核分枝桿菌的隔膜上，兩者相互作用的結(jié)構(gòu)域位于蛋白的羧基端，靠近溶菌酶結(jié)構(gòu)域，表明Rpf B和Rip A復(fù)合物在細(xì)菌復(fù)蘇時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞分裂［31］。谷氨酸棒桿菌含有rpf1和rpf2 2個(gè)基因，這2個(gè)基因編碼2種Rpf類似蛋白［32］。Panutdaporn等［22］在傷寒沙門氏菌LT2中發(fā)現(xiàn)1種復(fù)蘇促進(jìn)因子，由696 bp組成，表達(dá)的蛋白分子量約為25 k Da，能促進(jìn)細(xì)胞分裂，也能促進(jìn)VBNC細(xì)胞復(fù)蘇，與滕黃微球菌Rpf有24.2%的序列相似性，但沒有種間活性。Nichols等［23］提出沙門氏菌復(fù)蘇促進(jìn)因子YeaZ類似于Gcp，這2種蛋白都有肌動(dòng)蛋白折疊，沒有明顯的分泌信號(hào)，但兩者都是所研究的物種必需的蛋白。金黃色葡萄球菌的Gcp在細(xì)菌細(xì)胞壁合成過程及細(xì)胞自溶、細(xì)胞分裂中有重要作用，為細(xì)菌存活所必須，可能涉及底物肽聚糖的修飾及調(diào)節(jié)水解酶（Murein hydrolases）的表達(dá)和活性，gcp突變株細(xì)菌存活能力及對(duì)Triton X－100和抗生素的抵抗力降低［20］。

大部分Rpf蛋白家族成員包含信號(hào)肽和（或）跨膜結(jié)構(gòu)域，表明它們可以與膜結(jié)合或者分泌到胞外行使功能。關(guān)于Rpf引發(fā)休眠狀態(tài)細(xì)菌復(fù)蘇的作用機(jī)制還處在探索階段，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Rpf樣蛋白的作用機(jī)制與溶菌酶有相似之處，都是對(duì)細(xì)胞壁的肽聚糖進(jìn)行了水解［24－33］。也有學(xué)者認(rèn)為Rpf樣蛋白的作用類似于細(xì)胞因子，能夠與細(xì)菌細(xì)胞表面的某種傳遞生長(zhǎng)信號(hào)的受體相結(jié)合刺激細(xì)菌生長(zhǎng)，然而至今仍未找到相關(guān)的受體［22］。

本文從副溶血弧菌基因組中克隆的Rpf家族糖蛋白酶基因由702 bp組成，編碼233個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，沒有明顯的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，其序列與哈維氏弧菌、溶珊瑚弧菌、擬態(tài)弧菌、費(fèi)氏弧菌、殺鮭弧菌等的糖蛋白酶或肽酶有較高的相似性，相似性范圍為67%～92%，與變形桿菌和沙門氏菌復(fù)蘇促進(jìn)因子的相似性分別為55%和57%，與耶爾森氏菌的M22肽酶YeaZ的相似性為55%。將該基因克隆于大腸桿菌表達(dá)載體，SDS－PAGE電泳分析表明目的蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)；采用Ni親和層析柱純化的Gcp為單一的蛋白帶，利用純化的Gcp免疫新西蘭大白兔制備特異性抗體，Western－blotting方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)正常生長(zhǎng)的副溶血弧菌8621.4細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Gcp蛋白，在培養(yǎng)上清中檢測(cè)不到表達(dá)的Gcp，分子量約為27 k Da，與已報(bào)道其他細(xì)菌的Rpf分子量相近；VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)過程中（低溫寡營(yíng)養(yǎng)）的副溶血弧菌8621.4菌體也能特異性表達(dá)該蛋白，而在VBNC狀態(tài)的菌體中檢測(cè)到2條特異表達(dá)蛋白帶，其中1條蛋白的分子量為27 k Da，另一條蛋白的分子量約為54 k Da，推測(cè)其為Gcp蛋白的二聚體，這可能是其N端的NH2和C端的COOH發(fā)生偶聯(lián)所致，而且這種偶聯(lián)不能被SDS打斷，但偶聯(lián)的具體化學(xué)鍵很難斷定。隨后的研究工作將集中于表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能及突變株的構(gòu)建及性質(zhì)研究。

［1］ Lee K K，Liu P C，Huang C Y.Vibrio parahaemolyticus infectious for both humans and edible mollusk abalone［J］.Microbiol and Infection，2003，5（6）：481－485.

［2］ Chowdhury M A R，Yamanaka H，Miyoshi S，et al.Ecology and seasonal distribution of Vibrio parahaemolyticus in aquatic environments of a temperate region［J］.FEMS Microbiol Ecol，1990，74（1）：1－10.

［3］ Honda T，Iida T.The pathogenicity of Vibrio parahaemolyticus and the role of the thermostable direct heamolysin and related heamolysins［J］.Reviews in Medical Microbiol，1993，4：106－113.

［4］ Lee C Y，Cheng M F，Yu M S，et al.Purification and characterization of a putative virulence factor，serine protease，from Vibrio parahaemolyticus［J］.FEMS Microbiol Lett，2002，209（1）：31－37.

［5］ Makino K，Oshima K，Kurokawa K，et al.Genome sequence of Vibrio parahaemolyticus：a pathogenic mechanism distinct from that of V.cholerae［J］.Lancet，2003，361（9359）：743－749.

［6］ Xu H S，Roberts N，Singleton F L，et al.Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment［J］.Microbiol Ecol，1982，8（4）：313－323.

［7］ Oliver J D.The Viable but nonculturable state in bacteria［J］.J Microbiol，2005，43：93－100.

［8］ Caro A，Got P，Lesne J，et al.Viability and virulence of experimentally stressed nonculturable Salmonella typhimurium［J］.Appl Environ Microbiol，1999，65（7）：3229－3232.

［9］ Rahman I，Shahamat M，Chowdhury M A，et al.Potential virulence of viable but nonculturable Shigella dysenteriae type 1［J］.Appl Environ Microbiol，1996，62（1）：115－120.

［10］ Chaiyanan S，Huq A，Maugel T，et al.Viability of the nonculturable Vibrio cholerae O1 and O139［J］.Syst Appl Microbiol，2001，24（3）：331－341.

［11］ Hoff K A.Survival of Vibrio anguillarum and Vibrio salmonicida at different salinities［J］.Appl Environ Microbiol，1989，55（7）：1775－1786.

［12］ Whitesides M D，Oliver J D.Resuscitation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable state［J］.Appl Environ Microbiol，1997，63（3）：1002－1005.

［13］ Sun F R，Chen J X，Zhong L H，et al.Characterization and virulence retention of viable but nonculturable Vibrio harveyi［J］.FEMS Microbiol Ecol，2008，64（1）：37－44.

［14］ Wong H C，Wang P，Chen S Y，et al.Resuscitation of viable but non－culturable Vibrio parahaemolyticus in a minimum salt medium［J］.FEMS Microbiol Lett，2004，233（2）：269－275.

［15］ 杜萌，陳吉祥，孫豐蓉，等.低溫寡營(yíng)養(yǎng)條件下副溶血弧菌形成活的非可培養(yǎng)狀態(tài)及其復(fù)蘇研究［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2008，32（2）：178－183.

［16］ Votyakova T V，Kaprelyants A S，Kell D B.Influence of viable cells on the resuscitation of dormant cells in Micrococcus luteus cultures held in an extended stationary phase：the population effect［J］.Appl Environ Microbiol，1994，60（9）：3284－3291.

［17］ Mukamolova G V，Kaprelyants A S，Young D I，et al.A bacterial cytokine［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（15）：8916－8921.

［18］ Mukamolova G V，Turapov O A，Young D I，et al.A family of autocrine growth factors in Mycobacterium tuberculosis［J］.Mol Microbiol，2002，46（3）：623－635.

［19］ Ravagnani A，F(xiàn)inan C L，Young M.A novel firmicute protein family related to the actinobacterial resuscitation－promoting factors by non－orthologous domain displacement［J］.BMC Genom－ics，2005，6（1）：39.

［20］ Sakata N，Terakubo S，Mukai T.Subcellular location of the soluble lytic transglycosylase homologue in Staphylococcus aureus［J］.Curr Microbiol，2005，50（1）：47－51.

［21］ Abdullah K M，Lo R Y，Mellors A.Cloning，nucleotide sequence，and expression of the Pasteurella haemolytica A1 glycoprotease gene［J］.J Bacteriol，1991，173（18）：5597－5603.

［22］ Panutdaporn N，Kawamoto K，Asakura H，et al.Resuscitation of the viable but non－culturable state of Salmonella enterica serovar Oranienburg by recombinant resuscitation－promoting factor derived from Salmonella Typhimurium strain LT2［J］.International Journal Food Microbiol，2006，106（3）：241－247.

［23］ Nichols C E，Johnson C，Lockyer M，et al.Structural characterization of Salmonella typhimurium YeaZ，an M22 O－sialoglycoprotein endopeptidase homolog［J］.PROTEINS，2006，64（1）：111－123.

［24］ Mukamolova G V，Murzin A G，Salina E G，et al.Muralytic activity of Micrococcus luteus Rpf and its relationship to physiological activity in promoting bacterial growth and resuscitation［J］.Mol Microbiol，2006，59（1）：84－98.

［25］ Mukamolova G V，Turapov O A，Kazarian K，et al.The rpf gene of Micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factor［J］.Mol Mirobiol，2002，46（3）：611－621.

［26］ Mukamolova G V，Turapov O A，Young D I，et al.A family of autocrine growth factors in Mycobacterium tuberculosis［J］.Mol Microbiol，2002，46（3）：623－635.

［27］ Downing K J，Mischenko V V，Shleeva M O，et al.Mutants of Mycobacterium tuberculosis lacking three of the five rpf－like genes are defective for growth in vivo and for resuscitation in vitro［J］.Infect Immun，2005，73（5）：3038－3043.

［28］ Kana B D，Gordhan B G，Downing K J，et al.The resuscitationpromoting factors of Mycobacterium tuberculosis are required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growth in vitro［J］.Mol Microbiol，2008，67（3）：672－684.

［29］ Ruggiero A，Tizzano B，Pedone E，et al.Crystal structure of the resuscitation－promoting factor（DeltaDUF）RpfB from M.tuberculosis［J］.J Mol Biol，2009，385（1）：153－162.

［30］ 師長(zhǎng)宏，趙勇，毛峰峰，等.復(fù)蘇促進(jìn)因子結(jié)合蛋白A的原核表達(dá)及對(duì)恥垢分枝桿菌的促生長(zhǎng)作用［J］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10（11）：2001－2004.

［31］ Hett E C，Chao M C，Steyn A J，et al.A partner for the resuscitation－promoting factors of Mycobacterium tuberculosis［J］.Mol Microbiol，2007，66（3）：658－668.

［32］ Hartmann M，Barsch A，Niehaus K，et al.The glycosylated cell surface protein Rpf2，containing a resuscitation－promoting factor motif，is involved in intercellular communication of Corynebacterium glutamicum［J］.Arch Microbiol，2004，182（4）：299－312.

［33］ Cohen－Gonsaud M，Keep N H，Davies A P，et al.Resuscitationpromoting factors possess a lysozyme－like domain［J］.Trends Biochem Sci，2004，29（1）：7－10.

Expression and Characterization of a Resuscitation－Promoting Factor Like Glycoprotease Gene from Vibrio parahaemolyticus

ZHAO Ming－Jun1，JIA Jun－Tao2，CHEN Ji－Xiang1，3
（1.The Key Laboratory of Marine Genetics and Gene Resource Exploitation of Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Shandong Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266002，China；3.Institute of Petrochemical Technology，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China）

A resuscitation－promoting factor like glycoprotease gene was cloned from the chromosomal DNA of pathogenic Vibrio parahaemolyticus 8621.4 by PCR amplification.The ORF of the glycoprotease gene consisted of 702 base pairs，encoding a polypeptide of 233 amino acids.The homologies of the nucleotide sequence with those of other V.parahaemolyticus stains were 100%.The similarities of the amino acid sequence with glycoproteases of Vibrio harveyi HY01，Vibrio sp.Ex25，Vibrio coralliilyticus，Vibrio mimicus and Vibrio salmonicida were from 67%to 92%.The glycoprotease gene was then subcloned into p ET28a and expressed in BL21（DE3）.The polyclonal antibody was prepared by immunization of rabbits with the expressed protein，which was purified by Ni（＋）－affinity chromatography.A specific protein band of 27 k Da was detected in the whole－cell lysate preparation of normal cultural cells and 45 days culture cells of V.parahaemolyticus 8621.4 at low temperature conditions by western－blotting analysis，and one additional band could be detected in the VBNC cells.These results may be of significance in evaluating the role of Gcp in entering into the VBNC state under starvation stresses and recovering from the VBNC state.

Vibrio parahaemolyticus；resuscitation－promoting factor；glycoprotease；expression；characterization

S941

A

1672－5174（2012）03－057－07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30972275）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2007AA09Z416）；國(guó)家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目（2010IK180）資助

2011－04－25；

2011－06－27

趙明君（1986－）女，碩士生，從事海洋微生物分子生物學(xué)研究。

＊＊通訊作者：E－mail：betcen＠ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 朱寶象