張海麗，邊海燕，楊躍志，李正炎，2＊＊

（中國海洋大學(xué)1.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院；2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266100）

酚類污染物對菲律賓蛤仔抗氧化和解毒系統(tǒng)相關(guān)酶活性的影響＊

張海麗1，邊海燕1，楊躍志1，李正炎1，2＊＊

（中國海洋大學(xué)1.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院；2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266100）

壬基酚、辛基酚、二氯酚和雙酚A是水環(huán)境中普遍存在的酚類污染物，由于其內(nèi)分泌干擾活性和致癌性近年來受到廣泛的關(guān)注。本研究以菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）為受試生物，研究4種典型酚類污染物暴露對其內(nèi)臟組織和鰓組織中抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）以及解毒酶谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）活性的影響。研究結(jié)果表明：壬基酚低濃度處理組（0.05～0.2 mg／L）3種酶活性無顯著變化，高濃度處理組（0.4 mg／L），SOD、CAT和GST 3種酶活性均受到顯著抑制，抑制率分別為56.6%，59.0%和35.5%。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍（0.05～0.4 mg／L）內(nèi)，二氯酚能夠顯著抑制內(nèi)臟組織CAT活性，雙酚A能夠顯著抑制鰓組織GST活性。3種酶活性變化對于酚類污染物的響應(yīng)呈現(xiàn)較好的規(guī)律性，因此可以作為生物標(biāo)志物聯(lián)合指示水體中的酚類污染。

酚類污染物；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶；谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶；生物標(biāo)志物

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs）可干擾機(jī)體正常的內(nèi)分泌功能，包括對生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的危害等［1－2］。在EDCs的研究中，具有雌激素活性的酚類內(nèi)分泌干擾物因其對人類及生物體健康的嚴(yán)重威脅和引起的環(huán)境污染問題而受到廣泛重視［3－4］。壬基酚（Nonylphenol，NP）、辛基酚（Octylphenol，OP）、二氯酚（2，4－Dichlorophenol，2，4－DCP）和雙酚A（Bisphenol A，BPA）都屬于此類物質(zhì)，能夠引起魚類和螺類等生物的性別反轉(zhuǎn)［5］，同時還具有致癌性、致畸性和致突變性［6］，因此引起了人們的普遍關(guān)注。壬基酚和辛基酚主要用于合成烷基酚聚氧乙烯醚，后者作為非離子表面活性劑被廣泛應(yīng)用于洗滌劑、紡織助劑以及造紙和農(nóng)用化學(xué)品中。二氯酚主要應(yīng)用于石化、殺蟲劑、木材防腐等行業(yè)。雙酚A則主要用于合成聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂等多種高分子材料［7］。

研究表明，壬基酚是膠州灣中濃度最高的酚類污染物，其次為雙酚A、辛基酚和二氯酚，4種酚類污染物的濃度范圍分別為20.2～268.7，1.5～161.5，2～16.1和2～9.5 ng／L；長江口及其臨近海域夏季表層水中壬基酚的濃度范圍為14.09～173.0 ng／L；黃河入?？诘貐^(qū)枯水期水體中NP的濃度范圍為15.7～148.6 ng／L［8］。由于這4種酚類物質(zhì)的廣泛應(yīng)用以及已報道的生物毒性，化學(xué)監(jiān)測只能反映采樣瞬間的污染物濃度，而生物監(jiān)測可以彌補(bǔ)化學(xué)監(jiān)測的一些不足，本研究試圖尋求簡單而有效的生物標(biāo)志物對水體中酚類的污染起到預(yù)警和監(jiān)測作用。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）以及解毒酶谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（Glutathion S－transferase，GST）是生物體內(nèi)重要的酶，許多學(xué)者已提出將機(jī)體抗氧化系統(tǒng)酶活力作為一類敏感的環(huán)境污染監(jiān)測指標(biāo)［9－11］。SOD和CAT都是抗氧化酶，由于生物體內(nèi)的抗氧化酶對污染物脅迫十分敏感，其活性變化可以為污染物脅迫下的機(jī)體氧化應(yīng)激提供敏感信息，因此抗氧化酶可被用作生物標(biāo)志物指示環(huán)境污染［12－13］。本研究以蛤仔為受試生物，通過研究NP，OP，BAP和2，4－DCP對蛤仔體內(nèi)CAT、SOD、GST活性的影響，探討酚類污染物對蛤仔的毒理學(xué)效應(yīng)，同時為酚類污染物的生物標(biāo)志物探索提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試生物

菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）是1種濾食性雙殼類生物，對污染物有很強(qiáng)的富集作用。實(shí)驗(yàn)生物采自青島膠州灣紅島養(yǎng)殖區(qū)，選取新鮮健康的菲律賓蛤仔個體用于試驗(yàn)，平均殼長2.0～3.5 cm。

1.2 試驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)之前，先將蛤仔置于經(jīng)煮沸消毒的潔凈海水中暫養(yǎng)1周。馴養(yǎng)條件：在溫度（20±1）℃下，連續(xù)充氣，采用自然光照，馴養(yǎng)期間不投餌，以保證蛤仔適應(yīng)正式的試驗(yàn)條件。每天換水，密切檢查蛤仔個體的健康狀況，如發(fā)現(xiàn)死亡、反應(yīng)不靈敏、行動呆滯等現(xiàn)象，及時除去病體以確保受試蛤仔個體的健康。

毒物暴露：將實(shí)驗(yàn)生物隨機(jī)分成6組，置于干凈的玻璃缸中（30 cm×20 cm×15 cm），每缸放置20只健康的蛤仔個體，同時加入新鮮消毒并用4層紗絹過濾的海水3L。最后分別加入壬基酚、辛基酚、雙酚A、二氯酚，根據(jù)酚類物質(zhì)的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各處理組4種酚類化合物的濃度分別為：0.05、0.1、0.2和0.4 mg／L，同時設(shè)置溶劑對照組，每組設(shè)定2個平行樣。培養(yǎng)溫度為（20±1）℃，連續(xù)充氣，采用自然光照，實(shí)驗(yàn)暴露期為7 d，實(shí)驗(yàn)期間不投餌。

1.3 酶活性測定

實(shí)驗(yàn)所需溶液全部預(yù)冷至0℃，暴露7 d后，從各試驗(yàn)組隨機(jī)選取5只蛤仔，分別取出鰓和內(nèi)臟組織，用濾紙吸干。取約0.1 g內(nèi)臟或鰓，稱重后置于干凈的玻璃勻漿器中，加入1 m L冰冷的磷酸鹽緩沖液（Na2HPO4·12H2O 0.125 mol·L－1＋KH2PO40.125 mol·L－1＋Na2EDTA0.05 mmol·L－1，p H＝7.6），勻漿2 min，然后在4℃下高速離心（15 000 r·min－1）20 min。取上清液，一部分進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定，另一部分進(jìn)行CAT，SOD和GST活力測定。

蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法［14］，取適量離心后的酶源上清液或其稀釋液，加入一定量的考馬斯亮藍(lán)，用紫外可見分光光度計在595 nm下測定吸光值以確定蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白為蛋白標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

SOD活性測定采用改進(jìn)的鄰苯三酚自氧化法［15］。酶活性單位定義為：每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時的酶量。CAT活性測定采用紫外分光光度法［16］，酶活性單位定義為：在25℃，100 s內(nèi)使H2O2分解一半時的酶蛋白量。GST活性測定參照Habig等［17］方法，以每分鐘每毫克蛋白催化生成1 nmol產(chǎn)物為1個酶活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用SPSS13.0和Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和圖表制作，采用單因素方差分析進(jìn)行不同處理組間數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 酚類化合物對蛤仔體內(nèi)SOD活性的影響

不同濃度的酚類化合物對蛤仔體內(nèi)SOD活性的影響如圖1所示。對于內(nèi)臟組織，低濃度的壬基酚（0.05～0.2 mg／L）處理組中SOD活性與對照組相比差異不顯著，高濃度的壬基酚（0.4 mg／L）處理組與對照組相比則表現(xiàn)為極顯著抑制（P＜0.01），SOD活性抑制率為56.6%。實(shí)驗(yàn)濃度范圍（0.05～0.4 mg／L）內(nèi)的辛基酚暴露組中SOD活性與對照組相比無顯著差異。雙酚A試驗(yàn)組中，隨暴露濃度的增加，SOD活性呈現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的現(xiàn)象，當(dāng)雙酚A濃度為0.1 mg／L時，SOD活性與對照組相比顯著升高（P＜0.05），酶活性誘導(dǎo)率為27.4%，隨后酶活性又下降至對照組水平。二氯酚處理組中SOD活性變化與壬基酚處理組變化趨勢相同，即全程均受到抑制，其中0.2和0.4 mg／L濃度組表現(xiàn)為極顯著抑制（P＜0.01），酶活性抑制率分別為31.3%和51.5%。

鰓組織中，壬基酚處理組SOD活性與對照組相比無顯著差異；辛基酚處理組，隨暴露濃度的升高，SOD活性總體呈先升高后降低趨勢，0.1，0.2 mg／L處理組與對照組相比分別表現(xiàn)為極顯著誘導(dǎo)（P＜0.01）和顯著誘導(dǎo)（P＜0.05）作用，酶活性誘導(dǎo)率分別為86.6%和56.8%。雙酚A處理組表現(xiàn)出與辛基酚相似的變化趨勢。當(dāng)二氯酚濃度為0.05 mg／L時，SOD活性與對照組相比顯著升高（P＜0.05），酶活性誘導(dǎo)率為67.8%，隨著二氯酚濃度的繼續(xù)升高，酶活性又下降至對照組水平（見圖1）。

2.2 酚類化合物對蛤仔體內(nèi)CAT活性的影響

不同濃度酚類化合物對蛤仔體內(nèi)CAT活性的影響（見表1，2），壬基酚處理組CAT活性呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，當(dāng)壬基酚濃度為0.2 mg／L時呈現(xiàn)顯著性抑制（P＜0.05），濃度為0.4 mg／L時表現(xiàn)為極顯著抑制（P＜0.01），內(nèi)臟組織和鰓組織中的酶活性抑制率分別為59.0%，52.6%。內(nèi)臟組織中，辛基酚處理組表現(xiàn)出與壬基酚處理組相反的變化趨勢，當(dāng)辛基酚濃度為0.2，0.4 mg／L時的酶活性誘導(dǎo)率分別為34.9%和40.6%。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，雙酚A處理組CAT活性與對照組相比無顯著變化；二氯酚處理組CAT活性則一直呈現(xiàn)極顯著性抑制（P＜0.01）。鰓組織中，隨辛基酚和雙酚A濃度的增加，CAT活性均呈現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的現(xiàn)象，且0.2 mg／L處理組與對照組相比呈現(xiàn)出顯著或極顯著性誘導(dǎo)。

圖1 酚類化合物對蛤仔體內(nèi)內(nèi)臟（■）和鰓（▲）SOD活性的影響Fig.1 The effect of phenolic chemicals on SOD activity of Ruditapes philippinarum

表1 酚類化合物對蛤仔內(nèi)臟CAT活性的影響Table 1 The effect of phenolic chemicals on visceral CAT activity of Ruditapes philippinarum

表2 酚類化合物對蛤仔鰓組織CAT活性的影響Table 2 The effect of phenolic chemicals on gill CAT activity of Ruditapes philippinarum

2.3 酚類化合物對蛤仔體內(nèi)GST活性的影響

不同濃度的酚類化合物對蛤仔體內(nèi)GST活性的影響如圖2所示。內(nèi)臟組織中，高濃度（0.4 mg／L）的壬基酚和辛基酚處理組與對照組相比均表現(xiàn)出顯著性抑制（P＜0.05），GST活性抑制率分別為35.5%和50.9%。實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的雙酚A暴露組中GST活性與對照組相比無顯著差異。二氯酚處理組GST活性表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，低濃度（0.1 mg／L）組與對照組相比表現(xiàn)出極顯著性差異（P＜0.01），GST活性是對照組的3.44倍，GST活性出現(xiàn)顯著升高，表明其酶活性被顯著誘導(dǎo)，隨著暴露濃度的進(jìn)一步升高，GST活性開始逐漸降低，與對照組相比無顯著性差異。

鰓組織中，實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的壬基酚和二氯酚暴露組中GST活性與對照組相比均無顯著差異。辛基酚處理組中，隨暴露濃度的增加，GST活性呈現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的現(xiàn)象，當(dāng)辛基酚濃度為0.2 mg／L時，GST活性與對照組相比呈極顯著性誘導(dǎo)（P＜0.01），酶活性誘導(dǎo)率為147.0%，當(dāng)暴露濃度繼續(xù)增加時，酶活性又有所下降。雙酚A處理組GST活性隨濃度的升高呈明顯的下降趨勢，且均表現(xiàn)出極顯著性抑制（P＜0.01），抑制率分別為40.4%，52.3%，59.3%，68.3%。

圖2 酚類化合物對蛤仔體內(nèi)GST活性的影響（＊：0.01＜P＜0.05；＊＊：P＜0.01）Fig.2 The effect of phenolic chemicals on GST activity of Ruditapes philippinarum

由以上圖和表可以得知，蛤仔內(nèi)臟組織中的SOD、CAT和GST活性高于鰓組織，這主要是由于內(nèi)臟團(tuán)中含有肝臟，而肝臟是生物體內(nèi)最主要的解毒器官，因此內(nèi)臟中抗氧化酶活性和解毒酶活性高于鰓組織。

3 討論

在污染物脅迫下，抗氧化酶的活性可能會發(fā)生誘導(dǎo)或抑制2種應(yīng)激改變［18］。誘導(dǎo)或抑制的出現(xiàn)，一方面取決于生物體遭受脅迫的強(qiáng)度和時間，另一方面與遭受脅迫的生物種類的敏感性有關(guān)。誘導(dǎo)效應(yīng)可以認(rèn)為是生物體為克服不良環(huán)境和防止中毒而做出的1種適應(yīng)性改變；而活性的減弱則反映了生物體對環(huán)境壓力十分敏感并可能受到進(jìn)一步的損傷［19］。

當(dāng)蛤仔暴露于酚類污染物中時，由于酚類物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)而在蛤仔體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基，如H2O2，O－2，OH等，這些活性氧若不被及時清除，就會對生物體造成氧化損傷，引起DNA分子破壞、酶失活、脂質(zhì)過氧化以至細(xì)胞死亡，引發(fā)癌癥等疾?。?0－21］。而在抗氧化系統(tǒng)中，SOD能將O－2轉(zhuǎn)化成O2和H2O2，CAT能進(jìn)一步將H2O2轉(zhuǎn)化成水，2種抗氧化酶清除了這些活性氧自由基，在防御機(jī)體氧化損傷中起到了重要作用，防止機(jī)體受到氧代謝物的損傷［19，21］。GST是1種能與谷胱甘肽（GSH）發(fā)生加合反應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)或微粒體酶，是生物機(jī)體內(nèi)重要的代謝酶系之一，存在于機(jī)體的各組織中，具有消除體內(nèi)自由基和解毒雙重功能，其活性大小可體現(xiàn)出活性氧自由基的積累和對細(xì)胞膜損傷的程度［22－23］。

本實(shí)驗(yàn)表明，對于NP處理組，3種酶活性呈現(xiàn)相似的變化趨勢，即隨濃度上升呈明顯的下降趨勢。在較低濃度下，酶活性與對照組相比無顯著性變化，在較高濃度下3種酶活性才受到顯著性抑制，這可能是由于生物體內(nèi)代謝產(chǎn)生大量的O－2等活性氧自由基，在體內(nèi)不斷積累，當(dāng)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)不能消除這些活性氧時，它們對細(xì)胞產(chǎn)生了不可逆的傷害，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到一定程度的損傷，衰老加速，從而導(dǎo)致中毒反應(yīng)發(fā)生，使酶活性下降甚至失活，出現(xiàn)更為顯著的抑制［24－25］。張毅等［26］研究了壬基酚對鯽魚原代肝細(xì)胞抗氧化功能的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)壬基酚處理后的肝細(xì)胞SOD和CAT活性均受到抑制，與本文研究結(jié)果一致。然而呂玥等［27］在研究壬基酚對中華大蟾蜍蝌蚪的毒性效應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)暴露于低濃度壬基酚組的蝌蚪，CAT活性表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后恢復(fù)，在高濃度組則表現(xiàn)為誘導(dǎo)－恢復(fù)－誘導(dǎo)，與本文的研究結(jié)果不同。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，對于2，4－DCP暴露，內(nèi)臟組織CAT始終處于極顯著抑制狀態(tài)；對于BPA暴露，鰓組織GST始終處于極顯著抑制狀態(tài)，表明內(nèi)臟組織CAT對DCP污染反應(yīng)敏感，鰓組織GST對BPA污染反應(yīng)敏感。郭彤等［28］在壬基酚或雙酚A對原代培養(yǎng)鯽肝細(xì)胞毒性影響的研究中，發(fā)現(xiàn)鯽肝細(xì)胞暴露于不同濃度的NP或BPA24小時后，隨著NP、BPA濃度的升高，GST活性顯著增加，與本文的研究結(jié)果不一致，這可能是由于研究對象、暴露方式以及致毒途徑的不同所致。

菲律賓蛤仔體內(nèi)3種酶活性隨著壬基酚濃度的改變呈現(xiàn)出顯著性抑制，因此可以把3種酶作為水環(huán)境中指示壬基酚污染的生物標(biāo)志物。而對于2，4－DCP暴露，內(nèi)臟組織CAT始終處于極顯著抑制狀態(tài)；對于BPA暴露，鰓組織GST始終處于極顯著抑制狀態(tài)，因此可以把CAT作為水環(huán)境中指示二氯酚污染的生物標(biāo)志物，GST作為指示雙酚A的生物標(biāo)志物。

本研究結(jié)果表明，對于壬基酚、二氯酚和雙酚A這3種酚類內(nèi)分泌干擾物，SOD、CAT和GST活性在鰓與內(nèi)臟中的變化總體呈現(xiàn)較為明顯的規(guī)律性，因此可以嘗試用3種酶活性的變化來指示水體中的酚類物質(zhì)污染。但由于本研究為室內(nèi)模擬試驗(yàn)，抗氧化酶和解毒酶活性的變化是1個動態(tài)過程，受多種因素，如水體中污染物種類，暴露濃度，暴露時間以及受試生物種類的影響［25，29－30］。此外，在采用酶活性變化作為生物標(biāo)志物指示水體酚類污染時還需考慮溶解氧、溫度、個體不同發(fā)育階段等因素對酶活性的影響。

4 結(jié)論

（1）蛤仔內(nèi)臟組織中SOD、CAT和GST的活性一般高于鰓組織。

（2）NP處理組中，3種酶活性呈現(xiàn)相似的變化趨勢，低濃度下酶活性與對照組相比無顯著變化，高濃度下則受到顯著抑制。

（3）實(shí)驗(yàn)濃度范圍（0.05～0.4 mg／L）內(nèi)，二氯酚能夠顯著抑制內(nèi)臟組織CAT活性，雙酚A能夠顯著抑制鰓組織GST活性，表明內(nèi)臟組織CAT對二氯酚污染敏感，鰓組織GST對雙酚A污染敏感。

（4）對于壬基酚、二氯酚和雙酚A，SOD、CAT和GST活性在鰓與內(nèi)臟中的變化總體呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性，即隨著酚類化合物濃度的升高，酶活性均受到顯著抑制，因此可以嘗試用該3種酶活性的變化來指示水環(huán)境中的酚類污染。

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Effects of Phenolic Compounds on Enzyme Activities of Antioxidant and Detoxification Systems in Ruditapes philippinarum

ZHANG Hai－Li1，BIAN Hai－Yan1，YANG Yue－Zhi1，LI Zheng－Yan1，2
（Ocean University of China 1.College of Environmental Science and Engineering，Qingdao 266100，China；2.The Key Lab of Marine Environmental Science and Ecology，Ministry of Education，Qingdao 266100，China）

Phenolic compounds including nonylphenol，octylphenol，2，4－dichlorophenol and bisphenol A are widely concerned due to their endocrine disrupting activity and carcinogenicity.Taking Ruditapes philippinarum as an experimental species，this paper studies the activities of antioxidant and detoxification enzymes including superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT）and glutathione S－transferase（GST）in gill and visceral tissues in response to the exposure of these four phenolic chemicals.The results showed that the activities of SOD，CAT and GST did not change significantly under exposure to low concentrations of nonylphenol（0.05～0.2 mg／L）.The enzyme activities were，however，significantly inhibited under a high dose（0.4 mg／L）with an inhibition rate of 56.6%，59.0%and 35.5%respectively.Within the experimental concentration range（0.05～0.4 mg／L），dichlorophenol inhibited the visceral CAT activity significantly and bisphenol A inhibited the gill GST activity significantly.The three enzymes showed a dose response change in response to phenolic exposure，therefore，they could be adopted as biomarkers indicating phenolic pollution in aquatic environment.

phenolic compounds；superoxide dismutase；catalase；glutathion S－transferase；biomarker

X131.2

A

1672－5174（2012）03－021－06

國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)（2009ZX07528－006－03）；海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201005012－2）資助

2011－03－23；

2011－05－03

張海麗（1987－），女，碩士生。E－mail：zhanghaili1900＠126.com

＊＊通訊作者：E－mail：zhengyan＠ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 龐 旻