朱明東，蔣建雄，肖亮，艾辛，覃靜萍，陳智勇，易自力

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 芒屬植物研究所，湖南 長(zhǎng)沙410128）

＊芒（Miscanthussinensis）和五節(jié)芒（M.floridulus）系禾本科芒屬（Miscanthus）的2個(gè)主要種［1］，主要分布于東南亞地區(qū)。我國(guó)是芒和五節(jié)芒的主要分布中心，五節(jié)芒在長(zhǎng)江中下游以南地區(qū)有著廣泛分布，芒的分布范圍更廣，在黃河流域以南地區(qū)和東北地區(qū)都有分布。由于芒和五節(jié)芒均為多年生C4草本植物，具有生物質(zhì)產(chǎn)量高、纖維素含量高、高熱值、灰分含量低、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)繁殖快等特點(diǎn)，近年來(lái)已被視為極具開(kāi)發(fā)潛力的能源植物而受到高度關(guān)注。

作為新型的能源植物資源，芒和五節(jié)芒遺傳背景與親緣關(guān)系的探討自然是重要的研究?jī)?nèi)容。筆者在進(jìn)行我國(guó)芒屬植物資源調(diào)查與遺傳多樣性分析中，按照經(jīng)典的形態(tài)學(xué)分類(lèi)依據(jù)［2］，發(fā)現(xiàn)在芒和五節(jié)芒的部分重疊分布區(qū)有許多表型性狀介于兩者之間的中間類(lèi)型存在，主要表現(xiàn)為其圓錐花序類(lèi)似于芒，但小穗的形態(tài)則類(lèi)似于五節(jié)芒，同時(shí)開(kāi)花期介于2個(gè)種之間，疑似為芒與五節(jié)芒的自然雜交產(chǎn)物。研究自然雜交滲透主要有3個(gè)途徑，表型分析［3－5］，細(xì)胞生物學(xué)研究［6］和來(lái)自分子生物學(xué)［7－14］的證明。本研究即采用基于形態(tài)學(xué)標(biāo)記和Adh1基因序列標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育分析來(lái)證實(shí)這種種間自然雜交現(xiàn)象的存在與否。如果芒和五節(jié)芒存在自然雜交這一現(xiàn)象得到證實(shí)，不僅可以填補(bǔ)這一研究領(lǐng)域的空白，為闡明芒屬植物復(fù)雜的系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化關(guān)系提供理論基礎(chǔ)，而且還能為芒與五節(jié)芒作為能源植物應(yīng)用所需的遺傳改良提供雜交育種的依據(jù)。為了闡明這一問(wèn)題，筆者進(jìn)行了2個(gè)方面的研究：一是建立保存活體材料的資源圃，將不同生態(tài)來(lái)源的樣本種植在同樣的生態(tài)環(huán)境下，進(jìn)行多年份的形態(tài)學(xué)性狀考察分析，以排除環(huán)境飾變的影響；二是通過(guò)Adh1（乙醇脫氫酶）基因的序列分析來(lái)鑒定是否有種間雜種的存在，因?yàn)锳dh1基因具有豐富的多態(tài)性，已被廣泛應(yīng)用于研究植物的遺傳進(jìn)化和親緣關(guān)系，是揭示近緣種群間遺傳背景的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與來(lái)源

本試驗(yàn)所用植物材料的分類(lèi)名及其來(lái)源地見(jiàn)表1。具有中間性狀的疑似雜交種采自福建南平市芒與五節(jié)芒混生的地區(qū)。在本研究中用作外參照的芒（AD512）和五節(jié)芒（AA335）來(lái)源于湖南瀏陽(yáng)地區(qū)2個(gè)獨(dú)立的種群。取材料的根莖，種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物資源圃。該資源圃位于湖南省長(zhǎng)沙市東郊，北緯28°11′，東經(jīng)113°02′，海撥80m，土壤為紅壤土，肥力中等，屬亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候區(qū)。栽培方式為每4m3種植1株，按常規(guī)方法進(jìn)行一致的栽培管理。

表1 供試材料Table 1 Plant materials for this study

1.2 表型性狀分析

1.2.1 性狀測(cè)定 連續(xù)3年（2008，2009，2010）對(duì)供試材料的以下17個(gè)性狀進(jìn)行了測(cè)定，17項(xiàng)性狀包括旗葉長(zhǎng)（flag leaf length，F(xiàn)LL）、旗葉寬（flag leaf width，F(xiàn)LW）、最大葉片長(zhǎng)（largest leaf length，LLL）、最大葉片寬（largest leaf width，LLW）、每個(gè)分蘗葉片數(shù)（leaf number per tiller，LNT）、株高（plant height，PH）、莖長(zhǎng)（stem height，SH）、每分蘗莖節(jié)數(shù)（internode number per tiller，INT）、花序長(zhǎng)（panicle length，PL）、主軸長(zhǎng)（panicle main axis length，PMAL）、主軸長(zhǎng)／花序長(zhǎng)（panicle main／panicle length，PMAL／PL）、芒長(zhǎng)（awn length，AL）、基盤(pán)毛長(zhǎng)（callus hair length，CHL）、小穗長(zhǎng)柄長(zhǎng)（long stalk length，LSL）、小穗短柄長(zhǎng)（short stalk length，SSL）、種子長(zhǎng)（grain length，GL）、種子寬（grain width，GW）。葉片、莖稈及花序性狀考察時(shí)，取生長(zhǎng)正常、無(wú)病變植株測(cè)量，取5次重復(fù)平均數(shù)；小花性狀和種子性狀考察時(shí)，分別取無(wú)病變小花20朵和種子20枚計(jì)平均數(shù)。

1.2.2 性狀聚類(lèi) 形態(tài)性狀測(cè)定結(jié)果采用ZScores進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，計(jì)算13個(gè)材料的歐氏距離，在MVSP 3.2軟件上采用 Gower general similarity coefficient模型用 UPGMA 法聚類(lèi)。

1.3 Adh1基因序列分析

1.3.1 DNA提取與擴(kuò)增 基因組DNA采用改良的CTAB法進(jìn)行提取。基因片段的擴(kuò)增使用引物Adh1F－（5′－ATAGAGAGTGTTGGAGAGG－3′），Adh1R－（5′－GTTCTCCATGCGGATGATGC－3′）在 Biometro PCR儀器上進(jìn)行。擴(kuò)增用TaqDNA聚合酶來(lái)自東盛生物公司，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃1min，56℃1 min，72℃1.5min，34次循環(huán)；72℃延伸7min。擴(kuò)增體系為：Primer mix 4μL，DNA 2μL，Plus mix 25μL，ddH2O補(bǔ)齊至50μL。

1.3.2 回收體系 PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠在TAE電泳檢測(cè)并回收目標(biāo)片段。產(chǎn)物回收使用OMEGA公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物回收試劑盒（E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit）。純化后的產(chǎn)物用PGT57R／T質(zhì)粒（Fer－mentas，InsTAcloneTM PCR Cloning Kit）鏈接，之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，在含氨芐青霉素和5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D半乳糖苷（X－gal）的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆。樣品送上海生工測(cè)序，測(cè)序引物使用M13R／F通用引物。

1.3.3 序列分析 序列的對(duì)齊使用ClustalX1.81［15］程序，對(duì)齊后的序列加以人工檢查?；驑?shù)的構(gòu)建采用MEGA4.0［16］程序。最大簡(jiǎn)約樹(shù)（maximum parsimony，MP）的構(gòu)建采用啟發(fā)式搜索，樹(shù)2等份再連接分支交換（TBR），自展檢測(cè)（bootstrap analysis）重復(fù)500次。鄰接樹(shù)（neighbor－joining，NJ）的構(gòu)建使用 Kimura兩參數(shù)模型（kimura 2－parameter），自展檢驗(yàn)（bootstrap analysis）重復(fù)1 000次。本研究中構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)所用的Adh1基因序列，除了來(lái)源于表1中所列的芒與五節(jié)芒材料之外，還從GeneBank中選用了2個(gè)五節(jié)芒（AJ515961和AJ515962）和3個(gè)芒（AJ515964、AJ515985和AJ515973）的Adh1基因序列進(jìn)行分析。同時(shí)選用了玉米（Zea mays）（ZL08591和 MX04049）、高粱（Sorghumamplum，Sorghumleiocladum）（DQ096179和DQ096187）、狼尾草（Pennisetumglaucum）（L20576和L20582）作為構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)的外類(lèi)群。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)聚類(lèi)分析

本研究對(duì)13份供試材料的17個(gè)表型性狀進(jìn)行連續(xù)3年測(cè)定，測(cè)量均值見(jiàn)表2。在形態(tài)性狀聚類(lèi)分析中，利用 MVSP 3.2軟件采用Gower general similarity coefficient模型進(jìn)行 UPGMA聚類(lèi)分析，形態(tài)性狀聚類(lèi)結(jié)果見(jiàn)圖1。形態(tài)學(xué)性狀的聚類(lèi)結(jié)果顯示，芒和五節(jié)芒在聚類(lèi)圖中可以被完全區(qū)分開(kāi)。而6份疑似雜交種則沒(méi)有能夠單獨(dú)聚為一類(lèi)，其中疑似雜交種AD431與五節(jié)芒類(lèi)群（AA335和AD625）聚為一大類(lèi)，而疑似雜交種AA343、AD628、AD607、AD633和AD606與芒類(lèi)群（AD623、AD512、AD620、AD619和AD627）聚為另一大類(lèi)（圖1）。這表明形態(tài)性狀聚類(lèi)分析不能鑒定出雜交種的真實(shí)性。

2.2 Adh1基因序列特征及聚類(lèi)分析

2.2.1 基因序列的特征 分別從13份供試材料擴(kuò)增出的目的片段大小均為1 400bp左右，經(jīng)測(cè)序后得到堿基序列，將所測(cè)序列在GeneBank中比對(duì)證實(shí)均為Adh1基因，經(jīng)整理上傳至GeneBank后獲得序列號(hào)（表1）。

表2 17項(xiàng)表型性狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 17morphological characters

圖1 基于17個(gè)表型性狀標(biāo)記的聚類(lèi)圖Fig.1 Cluster analysis based on 17morphological traits

在Softberry上運(yùn)用FGENESH進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明芒屬植物的Adh1基因包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，外顯子片段大小為60～210bp，平均大小為114bp；在13份材料用來(lái)構(gòu)樹(shù)的19個(gè)序列中，序列大小為1 413～1 444bp，平均大小為1 430bp，A，T，C，G堿基含量分別為24.7%，30.3%，20.5%，24.5%，序列有明顯的T堿基偏好，AT堿基含量（55.0%）明顯大于CG堿基含量（45%）。當(dāng)用ClustalX對(duì)齊20個(gè)序列并排除空位和多重迭代后顯示序列長(zhǎng)度為1 473bp。顛換值為16，轉(zhuǎn)換值為27，轉(zhuǎn)換（SV）明顯大于顛換（SI），轉(zhuǎn)換與顛換的比為1.7。

2.2.2 聚類(lèi)分析 序列采用ClustalX1.81程序排除空位并對(duì)齊，用MEGA4.0程序構(gòu)建Adh1基因序列的最大簡(jiǎn)約樹(shù)（MP）和鄰接樹(shù)（NJ），結(jié)果如圖2和3所示，分支上的數(shù)值顯示其自展支持率。

最大簡(jiǎn)約樹(shù)和鄰接樹(shù)具有基本一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，芒屬作為單系類(lèi)群能夠很好地與狼尾草、玉米和高粱等外類(lèi)群區(qū)分開(kāi)。在芒屬分支中，芒和五節(jié)芒的材料被分別聚成可明顯區(qū)分的2類(lèi)。而在每一個(gè)疑似雜交種中，均檢測(cè)到有2種Adh1基因單倍型的存在，其中一個(gè)為芒的單倍型，在系統(tǒng)樹(shù)中與其他芒的Adh1基因聚為一類(lèi)；另一個(gè)為五節(jié)芒的單倍型，在系統(tǒng)樹(shù)中則與其他五節(jié)芒的Adh1基因聚為一類(lèi)?；贏dh1基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這些疑似雜交種確實(shí)為芒與五節(jié)芒自然雜交的產(chǎn)物。

3 討論

本研究驗(yàn)證了疑似雜交種的真實(shí)性，證實(shí)了芒與五節(jié)芒的種間自然雜交現(xiàn)象的存在。這2個(gè)物種之所以能夠產(chǎn)生自然雜交，可能的原因主要有如下幾個(gè)方面：一是芒和五節(jié)芒親緣關(guān)系很近，為近緣種，具有相近的遺傳基礎(chǔ)，二倍體的染色體數(shù)目均為2n＝2x＝38；二是兩者的地理分布上有重疊，在野外種質(zhì)資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在有五節(jié)芒分布的地區(qū)，幾乎也都有芒的分布，在部分地區(qū)兩者甚至混生在一起；三是芒和五節(jié)芒均為較嚴(yán)格的自交不親和植物，有性生殖以異花授粉為主。據(jù)中國(guó)植物志記載，芒的開(kāi)花期通常是8－10月，而五節(jié)芒的開(kāi)花期為5－6月，兩者開(kāi)花期相差較大。但在研究中發(fā)現(xiàn)五節(jié)芒的生殖分蘗中下部的節(jié)位有時(shí)候會(huì)發(fā)生第2次抽穗開(kāi)花的現(xiàn)象，花期剛好與芒的花期相重疊，為兩者發(fā)生自然雜交提供了花期相遇的可能。為了進(jìn)一步證實(shí)芒與五節(jié)芒的種間雜交現(xiàn)象，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物研究所開(kāi)展了人工雜交試驗(yàn)，并成功獲得了真實(shí)的雜交種，說(shuō)明芒與五節(jié)芒之間確實(shí)具有發(fā)生種間雜交的遺傳基礎(chǔ)。芒屬植物不同的種群間存在的這種自然雜交現(xiàn)象，會(huì)使得芒屬植物種群內(nèi)和種群間的遺傳與進(jìn)化關(guān)系變得更為復(fù)雜，這無(wú)疑給其經(jīng)典分類(lèi)學(xué)和系統(tǒng)學(xué)研究增加了難度。因此長(zhǎng)期以來(lái)，基于形態(tài)學(xué)鑒定的有關(guān)芒屬的分類(lèi)及其親緣關(guān)系研究一直都存在著爭(zhēng)議，屬下等級(jí)的劃分也有不同的歸并與拆分結(jié)果［1，2］。

圖2 基于Adh1基因序列的最大簡(jiǎn)約樹(shù)Fig.2 Maximum parsimony（MP）of Adh1gene sequence

圖3 基于Adh1基因序列的鄰接樹(shù)Fig.3 Neighbor－joining（NJ）of Adh1gene sequence

本研究發(fā)現(xiàn)，采用基于形態(tài)學(xué)性狀的聚類(lèi)分析并不能有效的將雜交種區(qū)分開(kāi)來(lái)，而采用Adh1基因序列聚類(lèi)分析則成功將雜交種鑒定出來(lái)。導(dǎo)致這2種聚類(lèi)分析方法出現(xiàn)差異的本質(zhì)原因在于：自然雜交所產(chǎn)生的雜交種，往往會(huì)與親本再發(fā)生回交，出現(xiàn)所謂的漸滲雜交（introgressive hybridization）現(xiàn)象［17］，從而導(dǎo)致1個(gè)種群的基因逐漸滲入到了另1個(gè)種群的基因庫(kù)中。這種種群間的基因滲透，豐富了種群內(nèi)的遺傳背景，增大了種群內(nèi)的遺傳差異性和表型多樣性，為自然選擇提供了新的遺傳資源，促進(jìn)了物種的進(jìn)化。但與此同時(shí)，種間的這種基因滲透，則降低了種群間的遺傳差異性，使得種群間的遺傳背景和表型性狀趨于同化，從而導(dǎo)致這2個(gè)種群在進(jìn)化上表現(xiàn)出趨近的親緣關(guān)系。但漸滲雜交所帶來(lái)的遺傳物質(zhì)的改變，在DNA分子水平上都能體現(xiàn)出來(lái)，通過(guò)基因序列的測(cè)定也都能夠直接鑒定出來(lái)，包括內(nèi)含子和外顯子序列所發(fā)生的變化。從本研究的測(cè)序結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，雜交種Adh1基因的內(nèi)含子和外顯子堿基序列均發(fā)生了改變，外顯子堿基序列的變異更為豐富；而能夠反映到形態(tài)上出現(xiàn)差別性狀，僅僅只是那些由外顯子上的顯性基因所控制的少數(shù)性狀，大量的中性突變?cè)谛螒B(tài)學(xué)上是沒(méi)有反映的。因此，基因序列聚類(lèi)分析與形態(tài)性狀聚類(lèi)分析的結(jié)果出現(xiàn)差異是常見(jiàn)的，而基因序列聚類(lèi)分析結(jié)果所反映出的物種變化更本質(zhì)、更全面、更準(zhǔn)確，用它所鑒定出的雜交種也更可靠。

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