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        基于形態(tài)性狀及Adh1基因序列的芒與五節(jié)芒自然雜交現(xiàn)象研究

        2012-01-02 02:48:50朱明東蔣建雄肖亮艾辛覃靜萍陳智勇易自力
        草業(yè)學(xué)報(bào) 2012年3期
        關(guān)鍵詞:雜交種形態(tài)學(xué)雜交

        朱明東,蔣建雄,肖亮,艾辛,覃靜萍,陳智勇,易自力

        (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 芒屬植物研究所,湖南 長(zhǎng)沙410128)

        *芒(Miscanthussinensis)和五節(jié)芒(M.floridulus)系禾本科芒屬(Miscanthus)的2個(gè)主要種[1],主要分布于東南亞地區(qū)。我國(guó)是芒和五節(jié)芒的主要分布中心,五節(jié)芒在長(zhǎng)江中下游以南地區(qū)有著廣泛分布,芒的分布范圍更廣,在黃河流域以南地區(qū)和東北地區(qū)都有分布。由于芒和五節(jié)芒均為多年生C4草本植物,具有生物質(zhì)產(chǎn)量高、纖維素含量高、高熱值、灰分含量低、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)繁殖快等特點(diǎn),近年來(lái)已被視為極具開(kāi)發(fā)潛力的能源植物而受到高度關(guān)注。

        作為新型的能源植物資源,芒和五節(jié)芒遺傳背景與親緣關(guān)系的探討自然是重要的研究?jī)?nèi)容。筆者在進(jìn)行我國(guó)芒屬植物資源調(diào)查與遺傳多樣性分析中,按照經(jīng)典的形態(tài)學(xué)分類(lèi)依據(jù)[2],發(fā)現(xiàn)在芒和五節(jié)芒的部分重疊分布區(qū)有許多表型性狀介于兩者之間的中間類(lèi)型存在,主要表現(xiàn)為其圓錐花序類(lèi)似于芒,但小穗的形態(tài)則類(lèi)似于五節(jié)芒,同時(shí)開(kāi)花期介于2個(gè)種之間,疑似為芒與五節(jié)芒的自然雜交產(chǎn)物。研究自然雜交滲透主要有3個(gè)途徑,表型分析[3-5],細(xì)胞生物學(xué)研究[6]和來(lái)自分子生物學(xué)[7-14]的證明。本研究即采用基于形態(tài)學(xué)標(biāo)記和Adh1基因序列標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育分析來(lái)證實(shí)這種種間自然雜交現(xiàn)象的存在與否。如果芒和五節(jié)芒存在自然雜交這一現(xiàn)象得到證實(shí),不僅可以填補(bǔ)這一研究領(lǐng)域的空白,為闡明芒屬植物復(fù)雜的系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化關(guān)系提供理論基礎(chǔ),而且還能為芒與五節(jié)芒作為能源植物應(yīng)用所需的遺傳改良提供雜交育種的依據(jù)。為了闡明這一問(wèn)題,筆者進(jìn)行了2個(gè)方面的研究:一是建立保存活體材料的資源圃,將不同生態(tài)來(lái)源的樣本種植在同樣的生態(tài)環(huán)境下,進(jìn)行多年份的形態(tài)學(xué)性狀考察分析,以排除環(huán)境飾變的影響;二是通過(guò)Adh1(乙醇脫氫酶)基因的序列分析來(lái)鑒定是否有種間雜種的存在,因?yàn)锳dh1基因具有豐富的多態(tài)性,已被廣泛應(yīng)用于研究植物的遺傳進(jìn)化和親緣關(guān)系,是揭示近緣種群間遺傳背景的有效方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料與來(lái)源

        本試驗(yàn)所用植物材料的分類(lèi)名及其來(lái)源地見(jiàn)表1。具有中間性狀的疑似雜交種采自福建南平市芒與五節(jié)芒混生的地區(qū)。在本研究中用作外參照的芒(AD512)和五節(jié)芒(AA335)來(lái)源于湖南瀏陽(yáng)地區(qū)2個(gè)獨(dú)立的種群。取材料的根莖,種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物資源圃。該資源圃位于湖南省長(zhǎng)沙市東郊,北緯28°11′,東經(jīng)113°02′,海撥80m,土壤為紅壤土,肥力中等,屬亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候區(qū)。栽培方式為每4m3種植1株,按常規(guī)方法進(jìn)行一致的栽培管理。

        表1 供試材料Table 1 Plant materials for this study

        1.2 表型性狀分析

        1.2.1 性狀測(cè)定 連續(xù)3年(2008,2009,2010)對(duì)供試材料的以下17個(gè)性狀進(jìn)行了測(cè)定,17項(xiàng)性狀包括旗葉長(zhǎng)(flag leaf length,F(xiàn)LL)、旗葉寬(flag leaf width,F(xiàn)LW)、最大葉片長(zhǎng)(largest leaf length,LLL)、最大葉片寬(largest leaf width,LLW)、每個(gè)分蘗葉片數(shù)(leaf number per tiller,LNT)、株高(plant height,PH)、莖長(zhǎng)(stem height,SH)、每分蘗莖節(jié)數(shù)(internode number per tiller,INT)、花序長(zhǎng)(panicle length,PL)、主軸長(zhǎng)(panicle main axis length,PMAL)、主軸長(zhǎng)/花序長(zhǎng)(panicle main/panicle length,PMAL/PL)、芒長(zhǎng)(awn length,AL)、基盤(pán)毛長(zhǎng)(callus hair length,CHL)、小穗長(zhǎng)柄長(zhǎng)(long stalk length,LSL)、小穗短柄長(zhǎng)(short stalk length,SSL)、種子長(zhǎng)(grain length,GL)、種子寬(grain width,GW)。葉片、莖稈及花序性狀考察時(shí),取生長(zhǎng)正常、無(wú)病變植株測(cè)量,取5次重復(fù)平均數(shù);小花性狀和種子性狀考察時(shí),分別取無(wú)病變小花20朵和種子20枚計(jì)平均數(shù)。

        1.2.2 性狀聚類(lèi) 形態(tài)性狀測(cè)定結(jié)果采用ZScores進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換,計(jì)算13個(gè)材料的歐氏距離,在MVSP 3.2軟件上采用 Gower general similarity coefficient模型用 UPGMA 法聚類(lèi)。

        1.3 Adh1基因序列分析

        1.3.1 DNA提取與擴(kuò)增 基因組DNA采用改良的CTAB法進(jìn)行提取。基因片段的擴(kuò)增使用引物Adh1F-(5′-ATAGAGAGTGTTGGAGAGG-3′),Adh1R-(5′-GTTCTCCATGCGGATGATGC-3′)在 Biometro PCR儀器上進(jìn)行。擴(kuò)增用TaqDNA聚合酶來(lái)自東盛生物公司,擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃1min,56℃1 min,72℃1.5min,34次循環(huán);72℃延伸7min。擴(kuò)增體系為:Primer mix 4μL,DNA 2μL,Plus mix 25μL,ddH2O補(bǔ)齊至50μL。

        1.3.2 回收體系 PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠在TAE電泳檢測(cè)并回收目標(biāo)片段。產(chǎn)物回收使用OMEGA公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物回收試劑盒(E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit)。純化后的產(chǎn)物用PGT57R/T質(zhì)粒(Fer-mentas,InsTAcloneTM PCR Cloning Kit)鏈接,之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10,在含氨芐青霉素和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆。樣品送上海生工測(cè)序,測(cè)序引物使用M13R/F通用引物。

        1.3.3 序列分析 序列的對(duì)齊使用ClustalX1.81[15]程序,對(duì)齊后的序列加以人工檢查?;驑?shù)的構(gòu)建采用MEGA4.0[16]程序。最大簡(jiǎn)約樹(shù)(maximum parsimony,MP)的構(gòu)建采用啟發(fā)式搜索,樹(shù)2等份再連接分支交換(TBR),自展檢測(cè)(bootstrap analysis)重復(fù)500次。鄰接樹(shù)(neighbor-joining,NJ)的構(gòu)建使用 Kimura兩參數(shù)模型(kimura 2-parameter),自展檢驗(yàn)(bootstrap analysis)重復(fù)1 000次。本研究中構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)所用的Adh1基因序列,除了來(lái)源于表1中所列的芒與五節(jié)芒材料之外,還從GeneBank中選用了2個(gè)五節(jié)芒(AJ515961和AJ515962)和3個(gè)芒(AJ515964、AJ515985和AJ515973)的Adh1基因序列進(jìn)行分析。同時(shí)選用了玉米(Zea mays)(ZL08591和 MX04049)、高粱(Sorghumamplum,Sorghumleiocladum)(DQ096179和DQ096187)、狼尾草(Pennisetumglaucum)(L20576和L20582)作為構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)的外類(lèi)群。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 形態(tài)學(xué)聚類(lèi)分析

        本研究對(duì)13份供試材料的17個(gè)表型性狀進(jìn)行連續(xù)3年測(cè)定,測(cè)量均值見(jiàn)表2。在形態(tài)性狀聚類(lèi)分析中,利用 MVSP 3.2軟件采用Gower general similarity coefficient模型進(jìn)行 UPGMA聚類(lèi)分析,形態(tài)性狀聚類(lèi)結(jié)果見(jiàn)圖1。形態(tài)學(xué)性狀的聚類(lèi)結(jié)果顯示,芒和五節(jié)芒在聚類(lèi)圖中可以被完全區(qū)分開(kāi)。而6份疑似雜交種則沒(méi)有能夠單獨(dú)聚為一類(lèi),其中疑似雜交種AD431與五節(jié)芒類(lèi)群(AA335和AD625)聚為一大類(lèi),而疑似雜交種AA343、AD628、AD607、AD633和AD606與芒類(lèi)群(AD623、AD512、AD620、AD619和AD627)聚為另一大類(lèi)(圖1)。這表明形態(tài)性狀聚類(lèi)分析不能鑒定出雜交種的真實(shí)性。

        2.2 Adh1基因序列特征及聚類(lèi)分析

        2.2.1 基因序列的特征 分別從13份供試材料擴(kuò)增出的目的片段大小均為1 400bp左右,經(jīng)測(cè)序后得到堿基序列,將所測(cè)序列在GeneBank中比對(duì)證實(shí)均為Adh1基因,經(jīng)整理上傳至GeneBank后獲得序列號(hào)(表1)。

        表2 17項(xiàng)表型性狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 17morphological characters

        圖1 基于17個(gè)表型性狀標(biāo)記的聚類(lèi)圖Fig.1 Cluster analysis based on 17morphological traits

        在Softberry上運(yùn)用FGENESH進(jìn)行序列分析,結(jié)果表明芒屬植物的Adh1基因包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子,外顯子片段大小為60~210bp,平均大小為114bp;在13份材料用來(lái)構(gòu)樹(shù)的19個(gè)序列中,序列大小為1 413~1 444bp,平均大小為1 430bp,A,T,C,G堿基含量分別為24.7%,30.3%,20.5%,24.5%,序列有明顯的T堿基偏好,AT堿基含量(55.0%)明顯大于CG堿基含量(45%)。當(dāng)用ClustalX對(duì)齊20個(gè)序列并排除空位和多重迭代后顯示序列長(zhǎng)度為1 473bp。顛換值為16,轉(zhuǎn)換值為27,轉(zhuǎn)換(SV)明顯大于顛換(SI),轉(zhuǎn)換與顛換的比為1.7。

        2.2.2 聚類(lèi)分析 序列采用ClustalX1.81程序排除空位并對(duì)齊,用MEGA4.0程序構(gòu)建Adh1基因序列的最大簡(jiǎn)約樹(shù)(MP)和鄰接樹(shù)(NJ),結(jié)果如圖2和3所示,分支上的數(shù)值顯示其自展支持率。

        最大簡(jiǎn)約樹(shù)和鄰接樹(shù)具有基本一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),芒屬作為單系類(lèi)群能夠很好地與狼尾草、玉米和高粱等外類(lèi)群區(qū)分開(kāi)。在芒屬分支中,芒和五節(jié)芒的材料被分別聚成可明顯區(qū)分的2類(lèi)。而在每一個(gè)疑似雜交種中,均檢測(cè)到有2種Adh1基因單倍型的存在,其中一個(gè)為芒的單倍型,在系統(tǒng)樹(shù)中與其他芒的Adh1基因聚為一類(lèi);另一個(gè)為五節(jié)芒的單倍型,在系統(tǒng)樹(shù)中則與其他五節(jié)芒的Adh1基因聚為一類(lèi)?;贏dh1基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明,這些疑似雜交種確實(shí)為芒與五節(jié)芒自然雜交的產(chǎn)物。

        3 討論

        本研究驗(yàn)證了疑似雜交種的真實(shí)性,證實(shí)了芒與五節(jié)芒的種間自然雜交現(xiàn)象的存在。這2個(gè)物種之所以能夠產(chǎn)生自然雜交,可能的原因主要有如下幾個(gè)方面:一是芒和五節(jié)芒親緣關(guān)系很近,為近緣種,具有相近的遺傳基礎(chǔ),二倍體的染色體數(shù)目均為2n=2x=38;二是兩者的地理分布上有重疊,在野外種質(zhì)資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn),在有五節(jié)芒分布的地區(qū),幾乎也都有芒的分布,在部分地區(qū)兩者甚至混生在一起;三是芒和五節(jié)芒均為較嚴(yán)格的自交不親和植物,有性生殖以異花授粉為主。據(jù)中國(guó)植物志記載,芒的開(kāi)花期通常是8-10月,而五節(jié)芒的開(kāi)花期為5-6月,兩者開(kāi)花期相差較大。但在研究中發(fā)現(xiàn)五節(jié)芒的生殖分蘗中下部的節(jié)位有時(shí)候會(huì)發(fā)生第2次抽穗開(kāi)花的現(xiàn)象,花期剛好與芒的花期相重疊,為兩者發(fā)生自然雜交提供了花期相遇的可能。為了進(jìn)一步證實(shí)芒與五節(jié)芒的種間雜交現(xiàn)象,湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物研究所開(kāi)展了人工雜交試驗(yàn),并成功獲得了真實(shí)的雜交種,說(shuō)明芒與五節(jié)芒之間確實(shí)具有發(fā)生種間雜交的遺傳基礎(chǔ)。芒屬植物不同的種群間存在的這種自然雜交現(xiàn)象,會(huì)使得芒屬植物種群內(nèi)和種群間的遺傳與進(jìn)化關(guān)系變得更為復(fù)雜,這無(wú)疑給其經(jīng)典分類(lèi)學(xué)和系統(tǒng)學(xué)研究增加了難度。因此長(zhǎng)期以來(lái),基于形態(tài)學(xué)鑒定的有關(guān)芒屬的分類(lèi)及其親緣關(guān)系研究一直都存在著爭(zhēng)議,屬下等級(jí)的劃分也有不同的歸并與拆分結(jié)果[1,2]。

        圖2 基于Adh1基因序列的最大簡(jiǎn)約樹(shù)Fig.2 Maximum parsimony(MP)of Adh1gene sequence

        圖3 基于Adh1基因序列的鄰接樹(shù)Fig.3 Neighbor-joining(NJ)of Adh1gene sequence

        本研究發(fā)現(xiàn),采用基于形態(tài)學(xué)性狀的聚類(lèi)分析并不能有效的將雜交種區(qū)分開(kāi)來(lái),而采用Adh1基因序列聚類(lèi)分析則成功將雜交種鑒定出來(lái)。導(dǎo)致這2種聚類(lèi)分析方法出現(xiàn)差異的本質(zhì)原因在于:自然雜交所產(chǎn)生的雜交種,往往會(huì)與親本再發(fā)生回交,出現(xiàn)所謂的漸滲雜交(introgressive hybridization)現(xiàn)象[17],從而導(dǎo)致1個(gè)種群的基因逐漸滲入到了另1個(gè)種群的基因庫(kù)中。這種種群間的基因滲透,豐富了種群內(nèi)的遺傳背景,增大了種群內(nèi)的遺傳差異性和表型多樣性,為自然選擇提供了新的遺傳資源,促進(jìn)了物種的進(jìn)化。但與此同時(shí),種間的這種基因滲透,則降低了種群間的遺傳差異性,使得種群間的遺傳背景和表型性狀趨于同化,從而導(dǎo)致這2個(gè)種群在進(jìn)化上表現(xiàn)出趨近的親緣關(guān)系。但漸滲雜交所帶來(lái)的遺傳物質(zhì)的改變,在DNA分子水平上都能體現(xiàn)出來(lái),通過(guò)基因序列的測(cè)定也都能夠直接鑒定出來(lái),包括內(nèi)含子和外顯子序列所發(fā)生的變化。從本研究的測(cè)序結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),雜交種Adh1基因的內(nèi)含子和外顯子堿基序列均發(fā)生了改變,外顯子堿基序列的變異更為豐富;而能夠反映到形態(tài)上出現(xiàn)差別性狀,僅僅只是那些由外顯子上的顯性基因所控制的少數(shù)性狀,大量的中性突變?cè)谛螒B(tài)學(xué)上是沒(méi)有反映的。因此,基因序列聚類(lèi)分析與形態(tài)性狀聚類(lèi)分析的結(jié)果出現(xiàn)差異是常見(jiàn)的,而基因序列聚類(lèi)分析結(jié)果所反映出的物種變化更本質(zhì)、更全面、更準(zhǔn)確,用它所鑒定出的雜交種也更可靠。

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