許璐，蘇雪，董莉娜，張輝，陳紋，江龍龍，劉涇霞，孫坤

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

＊無性生殖習(xí)性是植物界普遍存在的一種現(xiàn)象，具無性生殖習(xí)性的植物（克隆植物）具有可塑性強、繁殖速度快的特點，可在短期內(nèi)占據(jù)各種不同生境，尤其是不良環(huán)境［1］，對物種的生存具有重要的意義。很多植物種類可以通過克隆生長產(chǎn)生與母株遺傳上完全相同的后代［2，3］，產(chǎn)生的無性系分株成活率高，提高了其在非最適條件，尤其是在惡劣環(huán)境條件（如高山和極地地區(qū)）下的生存力［4］。植物種群的克隆結(jié)構(gòu)及克隆多樣性是進化過程中適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果，深入研究種群的克隆結(jié)構(gòu)及克隆多樣性對了解克隆植物的種群形成、維持和衰退機制等有重要意義［5，6］。由于在野外精確鑒定克隆基株存在很大難度，嚴重制約了植物克隆結(jié)構(gòu)和克隆多樣性的研究。近年來，一些基于PCR的DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為準(zhǔn)確鑒定克隆基株提供了可靠的技術(shù)保障，已開始被用于植物克隆多樣性及克隆結(jié)構(gòu)的研究［7－9］。

中國沙棘（Hippophaerhamnoidesspp.sinensis）為我國的特有類群，是群落演替的先鋒物種，具有重要的水土保持和經(jīng)濟價值，主要分布于海拔400～3 100（3 900）m的山坡、草甸、谷地、河岸或干涸河床，在青藏高原東緣至黃土高原極為普遍。中國沙棘可通過根的萌蘗進行克隆繁殖，其根系主要由垂直根系和水平根系組成，克隆繁殖主要通過水平根系進行。迄今為止，對中國沙棘克隆生長的研究主要集中在外源激素、土壤水分對中國沙棘栽培群體克隆生長的影響［10，11］、中國沙棘克隆生長的生態(tài)學(xué)意義［12］和種群穩(wěn)定性維持途徑［13］等方面，而對自然生長的中國沙棘居群克隆結(jié)構(gòu)和克隆多樣性仍缺乏了解。為此，本研究使用RAPD作為遺傳標(biāo)記，對青藏高原東緣甘南藏族自治州的8個中國沙棘自然居群的克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu)進行了初步研究，旨在揭示沙棘屬植物的克隆繁殖能力和克隆分布特點，并為探討高山克隆植物對環(huán)境的適應(yīng)性策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地點位于青藏高原東緣的甘肅省甘南藏族自治州合作市境內(nèi)，平均海拔3 000m，屬典型的高原大陸性氣候，年平均降水量400～800mm，多集中于5－9月，年平均氣溫1～3℃［14］。分布于甘南的中國沙棘群落平均株高為1～5m，灌木層蓋度60%～95%，草本層蓋度50%～80%。在合作市郊和黨智溝分別選取中國沙棘自然居群各4個，設(shè)置大小為5m×6m的樣方，在樣方內(nèi)間隔1m進行個體采樣，并詳細繪制所采個體在居群內(nèi)的位置（圖1），摘取新鮮、無蟲斑和病斑的幼嫩葉片，硅膠快速干燥后用于DNA提取。在野外調(diào)查并記錄中國沙棘居群平均株高、群落優(yōu)勢種及生境的特征。具體采樣地點及居群特征見表1。

圖1 8個中國沙棘居群的克隆空間分布Fig.1 Clonal spatial distribution of eight H.rhamnoides populations

表1 中國沙棘采樣地點及生境條件Table 1 The habitats in sampling sites of H.rhamnoides spp.sinensis

1.2 總DNA的提取與檢測

采用改良的 CTAB法提取樣品總 DNA［15］，0.8%瓊脂糖凝膠檢測DNA樣品濃度，用去離子的滅菌水稀釋DNA至20ng／μL左右，置于4℃冰箱備用。

1.3 引物的篩選及PCR擴增和產(chǎn)物檢測

采用陳紋［16］在沙棘屬遺傳多樣性研究中篩選出的14條可以在中國沙棘居群內(nèi)擴增形成清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性高、多態(tài)性豐富的隨機引物作為擴增引物（表2）。

每個居群對全部個體進行PCR擴增。采用10 μL的反應(yīng)體系：DNA模板（5ng／μL）2μL；10×擴增緩沖液（500mmol／L Tris－HCl pH 8.3，2.5mg／mL的牛血清白蛋白（BSA），20mmol／L MgCl2）1μL；各200μmol／L dNTPs（上海Sangon生物工程公司）1μL；ED（10mmol／L Tris－HCl pH 8.3，2.5mg／mL BSA）1 μL；0.1μL（5U／μL）TaqDNA聚合酶（上海Sangon生物工程公司）；15ng／μL引物（上海Sangon生物工程公司）2μL；10%Ficoll（10mmol／L酒石黃，75μg／μL Ficoll 400）1μL；滅菌水1.9μL。PCR反應(yīng)在德國產(chǎn)Biometra PCR儀上進行。擴增程序為：95℃60s；95℃5s，37℃40s，72℃70s，1個循環(huán)后，95℃5s，37℃40s，72℃70s，39個循環(huán)，最后延伸72℃4min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，UVI凝膠圖像分析儀觀察并照相。

表2 用于中國沙棘克隆結(jié)構(gòu)研究的引物及序列Table 2 Sequences of primers used in analysis of H.rhamnoides spp.sinensis clonal structure

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)產(chǎn)物在電泳圖譜中的位置，按擴增陽性（1）和擴增陰性（0）記錄電泳譜帶，出現(xiàn)擴增條帶的記為1，相應(yīng)位置無擴增條帶的記為0，形成RAPD表型的0／1數(shù)據(jù)矩陣。應(yīng)用NTSYS軟件計算J＆C遺傳距離。居群內(nèi)個體間遺傳距離為0表示基因型相同，確定為同一基株克隆形成的不同分株。

中國沙棘的克隆多樣性水平用以下3個指數(shù)來判斷：

1）基因型比率（PD）［17］：PD＝G／N，其中G表示應(yīng)用RAPD標(biāo)記所能檢測到克隆繁殖的基因型，即基株數(shù)；N表示樣本數(shù)；由于PD受采樣策略和分株數(shù)目的影響，所以同時采用另一個更為客觀的指數(shù)來衡量克隆多樣性，即G／n，其中n為克隆繁殖形成的分株個數(shù)［18］。

2）Simpson’s多樣性指數(shù)（D）：通過Simpson多樣性指數(shù)可以估計居群內(nèi)克隆的多樣性水平［19］。公式為：D＝1－｛∑ni（ni－1）］／［N（N－1）］｝［20］。式中，ni表示基株i形成的分株數(shù)目；N為檢測的樣本數(shù)。D的變化范圍在0（居群由1種基因型構(gòu)成）～1（居群內(nèi)每一分株都由不同的基株形成）。

3）Fager’s指數(shù)（E）［21］：用來描述居群內(nèi)不同基因型分布的均度。可由下式計算得出：E＝D／Dmax，其中Dmax＝［N（n－1）］／［n（N－1）］。n表示每克隆繁殖形成的克隆數(shù)；N表示檢測的樣本數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國沙棘RAPD擴增

用14條隨機引物對8個中國沙棘居群共184個個體進行PCR擴增，14條隨機引物平均形成55.75種條帶，平均有15.13種條帶在中國沙棘居群內(nèi)表現(xiàn)出多態(tài)性，平均多態(tài)條帶百分率為27.64%。

2.2 克隆多樣性

中國沙棘居群不同基因型比例（G／n）從0.15到0.67不等（表3），平均為0.35，G6居群最高，G5居群最低；基因型比率（PD）平均為0.14；Simpson’s多樣性指數(shù)在G3、G6居群最高（0.99），G5居群的最低（0.69），平均為0.85。中國沙棘居群的Fager’s均勻度指數(shù)（E）的平均值為0.87，各居群的E值為0.70～1.00。

表3 中國沙棘居群的克隆多樣性Table 3 Clonal diversity in populations of H.rhamnoides spp.sinensis

2.3 克隆大小與克隆分布

8個中國沙棘居群共鑒別出26種不同的基因型（基株）。26種基株通過克隆繁殖形成的分株數(shù)分別為1～12個，共形成89個分株（表4）。中國沙棘各居群可檢測到的產(chǎn)生克隆分株的基株數(shù)平均為3.25個，平均克隆大小為每基株形成3.4個分株，65%的基株可形成1個以上的分株。

中國沙棘居群內(nèi)同一基株形成兩分株間的最大距離為5.8m，最小距離為1.0m。每基株形成分株之間最大距離的平均為3.4m。26種基株形成的89個分株間的總距離為138.2m，每克隆內(nèi)分株間的平均距離為1.75 m；同一克隆內(nèi)分株間的總距離為1.0～15.3m。8個中國沙棘居群的具體克隆分布情況如圖1。總體上，中國沙棘同一基株產(chǎn)生的克隆分株間的距離較大，分株的分布比較離散，即克隆分布主要為游擊型（guerilla growth form）分布。中國沙棘居群內(nèi)能夠進行克隆繁殖的基株數(shù)目（克隆數(shù)目）為2～4個，但各居群內(nèi)的克隆繁殖卻主要是由其中1種基株為主進行的，如基株類型g1－1、g2－1、g4－1 、g4－2 、g5－1 、g7－1 和g8－1在各居群中產(chǎn)生的分株數(shù)和分株的擴散能力都占優(yōu)勢（表1，圖1）。不同基株形成分株的能力和分布特點表明中國沙棘的克隆繁殖主要是以某一優(yōu)勢基株類型為主的方式。

2.4 居群株高和群落結(jié)構(gòu)對中國沙棘克隆多樣性的影響

中國沙棘的克隆多樣性指數(shù)與居群株高之間表現(xiàn)出一定的相關(guān)性。除居群G3（平均株高3m）外，隨著居群平均株高的增加，克隆多樣性水平有下降的趨勢（圖2）。居群G5的平均株高最大，在4m左右，但Simpson’s多樣性指數(shù)（D）、G／n值在8個居群間最低。最年輕的居群G6（平均株高1m）的G／n和D值最高。另外，分布于林緣灌叢類型為鮮黃小蘗＋中國沙棘的G3和G4居群相對于其他以中國沙棘為單優(yōu)勢種的灌叢中分布的中國沙棘居群具有較高的Simpson’s多樣性指數(shù)，D值分別為0.99和0.92。同一地點的中國沙棘自然居群，克隆多樣性與海拔之間并未表現(xiàn)出規(guī)律性的變化。

3 討論

3.1 中國沙棘克隆多樣性

植物的克隆多樣性與其繁殖特性有關(guān)［22］，中國沙棘為雌雄異株、風(fēng)媒傳粉的木本植物，可通過根的萌蘗進行克隆繁殖。與同是木本、雌雄異株的植物［如櫟屬的Quercuschrysolepis、歐洲山楊（Populustremula）［18，23］］相比，青藏高原東緣的中國沙棘自然居群檢測到的克隆多樣性指數(shù)較低：基因型比率（PD）平均值為0.14；Simpson’s多樣性指數(shù)（D）平均值為0.85；Fager’s均勻度指數(shù)（E）平均值為0.87。水生植物具有很強的克隆繁殖能力，Chen等［24］應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記對水生植物寬葉澤苔草（Caldesiagrandis）克隆多樣性的檢測結(jié)果為PD＝0.37，D＝0.91，E＝0.78。本研究結(jié)果表明，中國沙棘居群的克隆多樣性也低于水生植物寬葉澤苔草的克隆多樣性水平?？梢?，中國沙棘的克隆繁殖能力較強。本研究的8個中國沙棘居群都生長于高山環(huán)境，克隆繁殖占有一定的優(yōu)勢是其適應(yīng)高寒環(huán)境的繁殖對策?？寺∩L可以使克隆植物同一基因型內(nèi)資源共享與風(fēng)險分攤，通過頂端優(yōu)勢減小克隆分株內(nèi)的競爭，相對精確的分株放置和空間入侵，并迅速吸收有限資源并儲備供將來使用以及能有效地尋找空間，利用異質(zhì)性生境，增加了種群適合度［25，26］。

表4 中國沙棘各居群內(nèi)的克隆數(shù)及克隆分株間的距離Table 4 Clones number and the distance between ramets in populations

圖2 居群內(nèi)平均株高與克隆多樣性的關(guān)系Fig.2 Relationship between average plant height and clonal diversity

3.2 中國沙棘克隆大小和分布

本研究的8個中國沙棘居群均表現(xiàn)出一定的克隆擴散能力（表4），表現(xiàn)為每克隆內(nèi)分株間的平均距離為1.75m，同一克隆內(nèi)分株間的最大距離可達到15.3m，平均克隆大小為每基株形成3.4個分株，65%的基株可形成1個以上的分株。Suvanto和Latva－Karjanmaa［23］研究發(fā)現(xiàn)風(fēng)媒傳粉雌雄異株的木本植物歐洲山楊每基株可形成分株2.1個，能夠形成1個以上分株的基株占64%。同為風(fēng)媒傳粉、雌雄異株的木本植物中國沙棘居群的平均克隆大小要高于歐洲山楊。中國沙棘同一基株的克隆分株間的距離較大，分株的分布比較離散，其克隆分布主要表現(xiàn)為游擊型的分布特點。游擊型克隆植物具有很強的克隆擴散能力，宜于利用分散分布的資源，屬于資源開拓型［27，28］。這一分布特點有助于其在異質(zhì)的高原環(huán)境下積極尋找適宜的生存條件。

青藏高原東緣的中國沙棘克隆繁殖主要表現(xiàn)為居群內(nèi)存在以優(yōu)勢基株為主的克隆擴增。不同居群包含的克隆數(shù)目雖然為2～4個，但是每基株擁有的分株數(shù)卻從1～12個不等，并且在多數(shù)的居群中都有1～2種基因型占據(jù)相當(dāng)大的比例。青藏高原邊緣自然分布的中國沙棘往往形成密集的沙棘灌叢，群落形成過程中的競爭主要是在種內(nèi)個體之間進行，個體間的自疏現(xiàn)象影響了中國沙棘的克隆大小。不同的克?。ɑ蛐停Νh(huán)境具有不同的適應(yīng)性，那些適應(yīng)生長環(huán)境的克隆個體勢必會在整個居群中長期占有優(yōu)勢，這可能是中國沙棘克隆繁殖過程中存在優(yōu)勢基株類型的原因。

3.3 中國沙棘克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu)的影響因素

種群年齡和生態(tài)因子等都會影響植物的遺傳分化、克隆多樣性和克隆分布［6］。研究表明，中國沙棘居群的定居時間可能對克隆多樣性存在有明顯的影響。中國沙棘居群的平均株高在一定程度上可以反映居群的相對定居時間。總體上中國沙棘居群在定居的早期（如居群G6），其克隆多樣性較高，克隆繁殖現(xiàn)象不明顯。當(dāng)居群內(nèi)的植株形成高大喬木，整個居群處于穩(wěn)定的生長階段時，克隆繁殖則占有絕對優(yōu)勢。這可能是由于隨著定居時間的增加，居群內(nèi)競爭能力較強的植株通過克隆繁殖，形成更多的分株，獲得最佳的生存資源，排擠居群內(nèi)的其他植株并抑制其克隆繁殖，形成了某一優(yōu)勢基株占優(yōu)勢的分布特點。草本植物蛇莓（Duchesneaindica）的克隆繁殖也表現(xiàn)出在種群建立不久有最高的克隆多樣性，隨著時間的推移，種群中克隆多樣性逐漸降低［29］。環(huán)境的變化可以調(diào)節(jié)有性繁殖和克隆繁殖之間的平衡，是影響居群克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu)的一個機制［30］。中國沙棘的克隆多樣性與生境之間表現(xiàn)出一定的聯(lián)系。例如，居群G5是生長于河灘的以中國沙棘為優(yōu)勢種的沙棘灌叢，水源充足，不存在種間競爭，其長勢旺盛，克隆繁殖現(xiàn)象明顯，Simpson’s多樣性指數(shù)和均勻度E在8個居群中都最低，且同一克隆分株間的總距離高達15.3m，由1個優(yōu)勢基株（G5－1）形成了12個分株。而分布于林緣陰坡和半陰坡的居群G3和G4則表現(xiàn)出了較弱的克隆繁殖能力。這2個居群均生長于以鮮黃小蘗和中國沙棘為共優(yōu)種的灌叢，群落內(nèi)存在較強的種間競爭可能是中國沙棘居群內(nèi)克隆繁殖受到一定程度抑制的原因。Nicotra和Rodenhouse［31］也提出植物對資源可利用性的競爭會影響克隆植物的多樣性。另外，前人對蛇莓［29］和菊科Rutidosis leiolepis［32］的研究表明，其克隆繁殖能力隨著海拔的升高而增強。但本研究對合作黨智溝和市郊2個樣地不同海拔中國沙棘克隆多樣性的研究表明，其克隆多樣性與海拔之間沒有表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。本研究中，兩樣地中國沙棘的海拔僅有100～250m，海拔不明顯可能是未檢測到其克隆多樣性與海拔之間相關(guān)性的原因，今后還需要進行更深入的研究才能揭示中國沙棘克隆多樣性與海拔之間是否存在相關(guān)性。

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