曾亮，李敏權，＊，楊曉明

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院，甘肅 蘭州730070）

＊豌豆屬（Pisum）是豆科蠶豆族的一年或越年生草本植物，是糧菜飼兼用作物，喜冷凍濕潤氣候，幼苗能耐5℃低溫，生長期適溫12～16℃，結(jié)莢期適溫15～20℃，具有耐寒、耐旱、耐瘠等特點，因其適應性很強，在全世界的地理分布很廣［1］。中國是世界第二大豌豆主產(chǎn)國，廣闊的地理分布范圍和多樣化的生境造就了豐富的豌豆種質(zhì)資源，形成了豌豆的遺傳多樣性［2］。分析豌豆的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，不僅有利于豌豆種質(zhì)資源的合理保存、優(yōu)異豌豆種質(zhì)資源的挖掘與創(chuàng)新，而且對豌豆生產(chǎn)和育種也具有重要的指導意義。

ISSR（inter－simple sequence repeats）是一種建立在PCR反應基礎上的DNA分子標記技術，由Zietkiewicz等［3］于1994年創(chuàng)建。該技術克服了 RFLP（restriction fragment length polymorphism）、SSR（simple sequence repeat）、RAPD（random amplified polymorphic DNA）、AFLP（amplification fragment length polymorphism）等標記技術的一些局限性，具有無需預知基因組背景信息、DNA樣品用量少、信息量大、操作簡單、重復性好等優(yōu)點，現(xiàn)已被廣泛應用于植物的品種鑒定、基因定位、遺傳作圖、進化和系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究［4，5］。

對于豌豆屬種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究，以往主要是通過形態(tài)性狀和細胞學特征、SSR、AFLP、RAPD技術等進行分析，如宗緒曉等［6］利用SSR標記分析了國內(nèi)豌豆地方品種的遺傳多樣性，21對SSR引物共擴增出104個等位變異，有效等位變異為62.52%；Hoey等［7］利用同工酶和RAPD標記方法研究發(fā)現(xiàn)野生型和栽培型豌豆品種間有明顯差別；Samec和Nasinec［8］及Simioniuc等［9］利用RAPD和AFLP標記發(fā)現(xiàn)草料豌豆和粒用飼料豌豆有明顯差異。但是側(cè)重于豌豆屬植物ISSR分子標記的研究尚罕見報道。本研究應用ISSR標記技術，從DNA水平上探討了來自國內(nèi)外的73份豌豆品種種質(zhì)資源的遺傳多樣性與親緣關系，為有效利用DNA標記評價豌豆種質(zhì)資源親緣關系，保護和合理利用種質(zhì)資源以及加快新品種選育提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

73份豌豆材料為甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所多年來從全國各地引進和選育品種（表1），于2011年3月種植于甘肅省農(nóng)業(yè)科學院秦王川試驗基地。該試驗地位于甘肅省蘭州市永登縣秦川鎮(zhèn)，屬溫帶大陸性季風氣候，平均海拔2 100m，年降水量250～300mm。于5月采摘豌豆新鮮幼嫩葉，放入冰盒，帶回實驗室置于－80℃超低溫冰箱保存以備DNA提取。

表1 供試材料Table 1 Experiment materials

1.2 DNA提取和定量

每份材料取10～15個植株上的新鮮葉片，DNA提取采用改進CTAB法［10］；用0.8%的瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量；將所得的DNA提取液于紫外可見分光光度計上測定波長260和280nm處的吸光度OD260和OD280，計算OD260／OD280的值以檢測DNA樣品純度，檢測比值為1.8～1.9；用0.1倍TE將DNA稀釋至10ng／μL，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ISSR引物

選用加拿大哥倫比亞大學（University of British Colunbia Biotechnology，UBC）公布的100對ISSR引物（UBC801－UBC900），由上海生工生物技術公司合成。

1.4 PCR擴增及檢測

利用優(yōu)化的PCR反應體系從100條ISSR引物中篩選出11條對全部DNA樣品均有清晰、穩(wěn)定擴增產(chǎn)物且條帶清晰、重復性好的引物進行ISSR－PCR擴增，每條引物3次重復。20μL反應體系中各反應物含量為：15 ng模板DNA，0.2mmol／L dNTP，0.5μmol／L ISSR引物，1UTaq DNA聚合酶，2μL 10×PCR Buffer。PCR擴增程序為：94℃充分變性3min，然后進行以下34個循環(huán)：94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，最后于72℃延伸10min，4℃終止反應保存。

擴增產(chǎn)物在2%（W／V）的瓊脂糖凝膠（含EB 0.5μg／mL）、1×TAE緩沖液中電泳分離（5V／cm），用2 000 bp DNA Ladder作分子量標準，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍照記錄。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

同一引物擴增的電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性，選擇清晰的譜帶進行統(tǒng)計，擴增產(chǎn)物在相同遷移位置有帶賦值為1，無帶賦值為0，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。利用Popgen 32軟件計算ISSR擴增引物的Shannon多樣性信息指數(shù)，多態(tài)位點數(shù)，多態(tài)位點比率和有效等位基因數(shù)。采用NTSYS－PC 2.1軟件的SAHN程序和GS值按非加權配對算術平均法（UPGMA）計算各豌豆品種間的相似系數(shù)并進行聚類分析構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

從100條ISSR引物中篩選出11條多態(tài)性豐富、條帶清晰且重復性較好的引物，用于供試73個豌豆材料的PCR擴增。并根據(jù)各引物的特性和具體的擴增反應對照，確定了各引物的最佳退火溫度（表2）。

2.2 ISSR擴增結(jié)果及多態(tài)性分析

11條引物對73份豌豆材料共擴增出91條帶，大小為200～2 000bp（圖1），其中多態(tài)性條帶為78條，平均多態(tài)性比率達到86.4%。每個引物可擴增出2～12條多態(tài)性條帶，平均產(chǎn)生7條多態(tài)性譜帶。其中引物 UBC818、825、836、840的多態(tài)性信息含量達到了100%。這11條引物全部是二核苷酸重復序列類型的引物，其中（GA）n有3條，（CA）n有1條，（AC）n有4條，（AG）n有2條，（CT）n有1條，說明豌豆屬基因組中存在大量的（GA）、（AC）、（AG）等二核苷酸重復序列。Shannon多樣性信息指數(shù)評價樣品遺傳多樣性的結(jié)果表明，平均多樣性指數(shù)（I）為0.420 2，每個位點的有效等位基因數(shù)（Ne）為1.451 8（表3），表明豌豆材料間具有較高的多態(tài)性，遺傳多樣性較豐富。

表2 ISSR分析的引物序列Table 2 Primer sequences used in ISSR analysis

2.3 豌豆品種間遺傳相似性與差異性分析

根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，通過NTSYS－PC 2.1軟件對73份豌豆材料的遺傳相似系數(shù)（genetic similarity）和遺傳距離（genetic distance）進行計算，結(jié)果表明，73份豌豆材料間的遺傳相似系數(shù)為0.406 5～0.934 0，遺傳距離變幅范圍為0.059 2～0.987 4cm。其中，L1417和德豌之間的遺傳相似系數(shù)最?。?.406 5），遺傳距離最大（0.987 4cm），說明供試材料間二者親緣關系最遠；武威珍珠綠和珍珠綠之間的遺傳相似系數(shù)最大（0.934 0），遺傳距離最?。?.059 2cm），說明供試材料間二者親緣關系最近。在73份豌豆材料中來自于相同或相近地理位置的材料間遺傳相似系數(shù)值較大，親緣關系較近，而地理位置或生境相差較大的材料遺傳距離值較大，親緣關系較遠。整體看來，豌豆種質(zhì)資源間的遺傳基礎相對較寬，存在較大的遺傳變異性。

表3 73份豌豆材料ISSR標記擴增結(jié)果Table 3 The result of ISSR amplification of 73pea

圖1 引物UBC842對部分豌豆材料基因組DNA的PCR擴增結(jié)果Fig.1 Result of PCR amplication using primer UBC842of pea

2.4 豌豆品種間的ISSR聚類分析

利用UPGMA法對73份豌豆材料進行UPGMA聚類分析，繪出樹狀聚類圖（圖2）。在GS≈0.52處，可以把73份豌豆品種劃分為5類：第1類共8份材料，其中包括來自新西蘭的3份材料和國內(nèi)的5份材料；第2類共13份材料，主要是來自加拿大等地的6份國外材料和7份國內(nèi)材料；第3類包含的種質(zhì)資源最多，共37份材料，其中絕大部分是來自我國西北和華北的豌豆種質(zhì)資源；17號（X9002）與其余材料差異明顯，單獨聚為1類（第4類）；第5類的14份材料包括13份來自我國長江中下游及西南地區(qū)和1份來自荷蘭的豌豆種質(zhì)資源。從聚類結(jié)果可以看出，材料地理來源對系統(tǒng)聚類結(jié)果影響較大，各來源地材料在聚類圖中既有區(qū)別又有交叉，說明材料間形態(tài)性狀變異有一定的連續(xù)性。具有相同生長習性且地理來源相近的豌豆種質(zhì)資源聚為一類，聚類結(jié)果與豌豆地理來源、生長習性和生態(tài)分布密切關聯(lián)。

圖2 基于ISSR標記的73份豌豆材料聚類圖Fig.2 Dendrogram of cluster analysis based on ISSR of 73pea

3 討論

本研究采用ISSR標記對來自國內(nèi)外的豌豆屬植物資源進行了綜合分析，獲得了較為滿意的結(jié)果。由于ISSR標記具有無需預知基因組背景信息、信息量豐富、操作簡單、重復性好等諸多優(yōu)點，因而已被廣泛應用于植物遺傳多樣性的研究中。胡甦等［11］采用正交設計直觀分析法對影響三角紫葉酢漿草（Oxalistriangularis）ISSRPCR反應較大的5個因素在5個水平上進行了優(yōu)化，并由此建立了適合三角紫葉酢漿草的ISSR－PCR反應體系。馮亮亮等［12］在對甘肅地區(qū)紅砂（Reaumuriasoongorica）遺傳多樣性的ISSR分析表明，12條引物檢測到69個位點，其中多態(tài)性位點60個，多態(tài)位點比率達到86.96%，說明ISSR標記具有較高的多態(tài)性檢測水平。李鴻雁等［13］應用ISSR分子標記對分布于內(nèi)蒙古不同地區(qū)的扁蓿豆（Medicagoruthenica）進行了遺傳多樣性研究，結(jié)果表明，15個引物共擴增出363個位點，聚類結(jié)果顯示，生態(tài)地理條件相似的種群優(yōu)先聚類。王照蘭等［14］對扁蓿豆4個不同品系的ISSR遺傳多樣性分析表明，7個有效引物共擴增出73個位點，平均每條引物檢測出10.4個位點，多態(tài)位點百分率達到94.5%。耿立格等［15］對河北省的綠子葉黑豆（Glycinemax）種質(zhì)資源的ISSR遺傳多樣性分析表明，7個ISSR引物共檢測出60個等位變異，平均每個位點8.6個變異，變異幅度為5～17個，聚類結(jié)果顯示，類群與品種來源地無關。盧萍等［16］應用ISSR標記對小花棘豆（Oxytropisglabra）的6個地理種群進行的遺傳多樣性分析表明，14個引物共擴增出327個位點，多態(tài)位點比率在70%左右。從前人的研究結(jié)果可以看出，ISSR分子標記技術是有效揭示品種遺傳多樣性的一種手段。

宗緒曉等［17］對103份豌豆品種的SSR標記遺傳多樣性分析的結(jié)果表明，平均每對引物可以擴增出4.95個等位變異，多態(tài)性比率為65.56%，UPGMA聚類將供試豌豆聚成3類，生境和表型相近的種群基本聚為一類。陳永霞等［18］利用EST－SSR標記對西南扁穗牛鞭草（Hemarthriacompressa）的遺傳多樣性分析表明，23對引物共擴增出323條帶，多態(tài)性比率80.4%，聚類分析顯示，各供試材料間的聚類與其地理來源及形態(tài)特征具有一定的相關性。王海飛等［19］利用ISSR標記對527份蠶豆資源的遺傳多樣性分析表明，平均每對引物擴增條帶數(shù)為25，多態(tài)性比率為96%，聚類結(jié)果表明，生態(tài)地理條件相似的種群優(yōu)先聚集。本研究通過ISSR標記對豌豆進行遺傳多樣性分析表明，11條ISSR引物共擴增出91條條帶，多態(tài)性比率為86.4%，這與后者的研究結(jié)果較相近，其引物擴增的條帶數(shù)和多態(tài)性比率都高于用SSR分析的結(jié)果，說明ISSR標記對豌豆種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析更精確和可靠。聚類分析結(jié)果與前人研究結(jié)果相似，基本符合地理來源相近的居群聚為一類。

材料間遺傳差異、遺傳關系和遺傳多樣性評價對育種具有十分重要的意義［20，21］。應用分子標記技術研究遺傳關系時，引物數(shù)目和標記位點數(shù)會對結(jié)果產(chǎn)生影響，一般來說，所用引物數(shù)目越多、檢測的位點數(shù)越多，所提供的信息就越可靠。但在實際應用中，由于受到生物自身情況和時間、經(jīng)費等條件的制約，可供分析利用的引物數(shù)目和位點數(shù)都是有限的。有研究表明，所分析的位點數(shù)與所能提供信息的可靠性之間具有明顯的關系，當位點數(shù)超過70個時，所提供的信息可靠性趨于穩(wěn)定［22］。本試驗所篩選出的11個ISSR引物對73份豌豆材料共檢測到91個位點，其中多態(tài)性位點78個，因此能提供可靠的信息。

從73份豌豆材料的聚類圖可以看出在GS約為0.52處將73份材料聚為5類，聚類基本符合地理來源相近的居群聚為一類。但也有地理來源不同的品種被歸入一類，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能有2個方面：1）地理來源相同的材料雖然來自于同一環(huán)境，但是由于選擇方向的不同和選用育種材料的錯綜復雜，也可能形成遺傳差異較大的類型，因此出現(xiàn)地理來源相同的品種被歸入不同類群；2）受環(huán)境飾變作用的影響，物種在長期適應環(huán)境的過程中會出現(xiàn)某些性狀趨同的現(xiàn)象，造成不同物種性狀間的交叉。

4 結(jié)論

通過ISSR標記技術對73份豌豆材料的遺傳多樣性分析表明，100個ISSR引物中共篩選出11個多態(tài)性明顯、條帶清晰、反應穩(wěn)定的引物，多態(tài)性比率為86.4%。Shannon多樣性指數(shù)平均為0.420 2，品種間遺傳相似系數(shù)變幅范圍為0.406 5～0.934 0，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。利用UPGMA聚類分析，將73份材料劃分為5類，聚類結(jié)果呈一定的地域性分布規(guī)律。

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