【摘要】目的 探討死亡相關蛋白激酶基因啟動子區(qū)過甲基化與頸段食管癌的關系。方法 采用甲基化特異性PCR（MSP）法和逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法分析頸段食管部正常黏膜、頸段食管癌及相應癌旁組織中DAPK基因啟動子區(qū)過甲基化及其mRNA表達狀況。結果 42例頸段食管癌組織中，有27例(64.3%)DAPK基因啟動子區(qū)過甲基化，其在各病理分級和T分級之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而在N分級之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。25例癌旁組織中，有6例過甲基化，且均為頸段食管癌組織中有過甲基化的病例。頸段食管部正常組織、非甲基化的頸段食管癌組織和癌旁組織中均有DAPK mRNA表達。結論 頸段食管癌中DAPK基因啟動子區(qū)過甲基化與mRNA失表達有關，可能是頸段食管癌發(fā)生、發(fā)展的原因之一。

【關鍵詞】頸段食管腫瘤；蛋白激酶類/遺傳學；基因表達；DNA甲基化

死亡相關蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）是一種鈣離子和鈣調素依賴的絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶，它參與干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α、Fas等誘導的細胞凋亡過程，具有促進凋亡的功能［1］。DAPK的正常表達可抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移。有研究發(fā)現(xiàn)，在一些惡性細胞株或腫瘤組織中，DAPK表達缺失或極少表達，可能與其基因啟動子區(qū)CpG島過甲基化有關。為探討抑癌基因DAPK啟動子區(qū)CpG島過甲基化與頸段食管癌的關系，筆者觀察了頸段食管部正常組織、頸段食管癌及相應癌旁組織中DAPK基因啟動子區(qū)過甲基化及其mRNA表達情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 42例頸段食管癌及相應癌旁組織來源于筆者所在醫(yī)院手術切除的標本，25例癌旁組織取自腫瘤邊緣5 mm外區(qū)域，為肉眼下正常組織，且病理檢查未見癌細胞浸潤。5例頸段食管部正常組織來自頸段食管外傷手術修復的患者。頸段食管部組織切除后，立即放入－70 ℃冰箱中備用。42例頸段食管癌患者中，男34例，女8例。年齡最小者32歲，最大者78歲，平均53.4歲。術前均未經(jīng)化療或放療。全部頸段食管癌組織經(jīng)病理診斷均為鱗狀細胞癌，其中高分化17例，中分化10例，低分化15例。按1997年國際抗癌協(xié)會TNM標準，T1期7例，T2期9例，T3期15例，T4期11例，N0期29例，N1期13例。

1.2 主要試劑及儀器 基因組DNA修飾試劑盒購于美國Intergen公司；TRIzol試劑購于GIBCO公司；逆轉錄酶MLV為Promega公司產(chǎn)品。PCR儀為9600型，成像系統(tǒng)為Grab-it 4.0，分析軟件為Gelworks 1 D interdiate。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取和亞硫酸氫鈉修飾 DNA提取用酚氯仿抽提法。取1 μg DNA，用基因組DNA修飾試劑進行修飾。

1.3.2 甲基化特異性PCR DAPK基因的擴增用甲基化特異性PCR（MSP）法。甲基化引物：5-GGA TAG TCG GAT CGA GTT AAC GTC-3 (上游)，5-CCC TCC CAA ACG CCG-3（下游）；非甲基化引物：5-GGA GGA TAG TTG GAT TGA GTT AAT GTT-3（上游），5-CAA ATC CCT CCC AAA CAC CAA-3（下游）。反應條件為：95 ℃、5 min，然后95 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40個循環(huán)后，72 ℃、5 min。反應體系（25 μl）含模板約0.1 μg、0.4 μmol各引物、0.2 mmol dNTP、10 mmol 2-巰基乙醇、Mg2+ 1.5 mmol、1.0 UTaqDNA聚合酶、10×反應緩沖液2.5 μl（含硫酸氨）和適量水。為保證檢測的可靠性，以正常人外周血淋巴細胞DNA，經(jīng)SssI甲基轉移酶處理過的胎盤DNA和水，分別做非甲基化與甲基化的陽性對照和空白對照。取10 μl PCR擴增產(chǎn)物用3％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相。

RNA提取及RT-PCR檢測mRNA：?。?0 ℃存放的上述組織，每份約50 mg，用1 ml TRIzol（按說明書操作）逐步提取總RNA。CDNA第一鏈合成體系為25 U，每份取總RNA 2 μg，用逆轉錄酶MLV、oligodT以及相關試劑按說明配成適當濃度，合成cDNA。

根據(jù)GenBank中DAPK mRNA序列，用primer premier 5.0設計引物：5-GCC TGG AGA CGG AGA AGA T-3(上游)，5 -AAG TCC CGT GGC TGG TAG A-3（下游），內(nèi)參照－actin的引物：5-GTG CGT GAC ATT AAG GAG-3（上游），5-CTA AGT CAT AGT CCG CCT-3（下游）。為了確保內(nèi)參和目的基因的可比性，用primer dropping法（6）進行PCR擴增，即在擴增前先找出各自的平臺期，使反應終止于平臺期之前的指數(shù)增長期。PCR反應體系（25 μl）中含模板cDNA 2.5 μl、10 Buffer 2.5 μl、Mg 1.5 mmol、dNTP 0.4 mmol、0.3 μmol各引物，1 U Taq DNA聚合酶和適量水。反應條件為：95 ℃預變性5 min，然后95 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s。先加入DAPK基因引物，程序運行6個循環(huán)后再加入－actin引物，共28個循環(huán)，然后72 ℃延伸5 min。反應結束后取5 μl產(chǎn)物，用1.5％瓊脂糖凝膠（內(nèi)含EB）電泳，然后用grab-It成像系統(tǒng)照相并分析各條帶的吸光度值，以目的基因對β-catin的相對累積光密度值記錄結果。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計學分析，DAPK基因啟動子區(qū)甲基化與各臨床資料之間的關系用χ2檢驗，非甲基化的癌組織、癌旁及正常頸段食管部組織中mRNA表達的差異用方差分析。

2 結果

42例頸段食管癌組織中，有27例過甲基化，甲基化率為64.3%，甲基化產(chǎn)物為98 bp；5例正常頸段食管部組織均無DAPK基因甲基化；25例癌旁組織中，有6例發(fā)生甲基化，且均為相應癌組織中有甲基化的病例。DAPK基因過甲基化在頸段食管癌各病理分級和T分期間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而在N分期（N0和N1）間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。RT-PCR檢測結果示，所有甲基化的腫瘤組織中均無DAPK mRNA表達，而5例正常組織、19例癌旁組織和15非甲基化的頸段食管癌組織中均有其mRNA的表達，差異無顯著性（P=0.332）。

3 討論

目前的研究認為，DNA甲基化是一種新的基因調控機制，即基因序列不發(fā)生變化而基因表達受影響。DNA甲基化多數(shù)位于CpG島（CpG二核苷酸聚集區(qū)），而CpG島多集中分布于基因5端啟動子區(qū)域?；騿幼訁^(qū)CpG島過甲基化可通過抑制其轉錄，使該基因失活。Baylin等［2］研究發(fā)現(xiàn)，有多種抑癌基因的失活與其5端啟動子區(qū)CpG島過甲基化有關。MSP技術敏感性高，且特異性強，假陽性極少見。筆者采用MSP法，檢測了頸段食管癌中DAPK基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。

DAPK是一種調節(jié)細胞凋亡的正向調控因子，參與多種細胞凋亡信號傳導途徑，包括干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α、FAS、p53［3］和TGF-β［4］等。DAPK的表達缺失與其基因啟動子區(qū)域CpG島高頻率過甲基化在造血系統(tǒng)惡性腫瘤［5］、結腸直腸癌［6］、前列腺癌［7-8］、膀胱癌［9］、胃癌［10］、頭和頸腫瘤以及其他一些實體瘤中被發(fā)現(xiàn)。Jeong等［11］采用甲基化特異性聚合酶鏈式反應法，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中p16及DAPK的甲基化陽性率分別為57%及44.9%，較正常宮頸組織明顯升高。目前有關Barrett食管腺癌的研究中，檢測正常食管黏膜及食管腺癌的DAPK基因過甲基化率分別為20%和60%，并且發(fā)現(xiàn)DAPK啟動子的異常甲基化與DAPK蛋白的表達下降密切相關，而低表達DAPK的癌灶分級分期更高［12］。

本研究結果顯示，頸段食管癌中DAPK基因啟動子區(qū)CpG島過甲基化與其轉錄失活有關，可能是頸段食管癌發(fā)生的原因之一。在部分癌旁組織中也發(fā)現(xiàn)有甲基化，說明DAPK基因啟動子區(qū)CpG島過甲基化可能是頸段食管癌發(fā)生和發(fā)展過程中較早期的分子事件。

本研究表明，頸段食管癌組織中DAPK基因啟動子區(qū)甲基化率很高（62.7%），而正常頸段食管部黏膜組織中無甲基化，說明頸段食管癌的發(fā)生可能與DAPK基因甲基化有關。統(tǒng)計分析顯示，DAPK基因甲基化與臨床病理分級和T分期無關，而與有無淋巴結轉移有關。有研究顯示，肺癌細胞株的轉移能力與DAPK水平有關，在肺癌細胞株中恢復DAPK的生理水平可抑制其轉移能力。Tang等［13］在研究非小細胞肺癌中甲基化與其愈后的關系時發(fā)現(xiàn)，DAPK基因過甲基化的腫瘤患者5年生存率（56%）比非甲基化的腫瘤患者（92%）明顯降低。同時他還發(fā)現(xiàn)當用去甲基化藥物52aza2dc處理非小細胞肺癌時，這些細胞中的DAPK重新獲得表達和對腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的敏感性［14］。這些研究結果表明，DAPK有抑制腫瘤轉移的功能。檢測腫瘤組織中DAPK基因的甲基化，可為腫瘤預后分析提供理論依據(jù)。提示將脫甲基化藥物和死亡配體結合應用將會提升抗癌效果。因此，作為一種重要的誘導凋亡作用的蛋白激酶，DAPK在癌癥治療中可作為一種潛在的藥物作用靶點［15］。

總之，以往研究已發(fā)現(xiàn)多種抑癌基因的啟動子區(qū)過甲基化與腫瘤發(fā)生有關，頸段食管癌中也發(fā)現(xiàn)了一些抑癌基因的甲基化，但DAPK基因啟動子區(qū)過甲基化與頸段食管癌發(fā)生的確切關系，還需進一步研究。相信隨著研究的深入，抑癌基因啟動子區(qū)過甲基化將成為腫瘤診斷或預后估計的檢測指標。

參 考 文 獻

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