摘 要 目的：觀測血管性癡呆（VD）小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞及石杉堿甲的治療效果。方法：制作VD動物模型，并設(shè)立假手術(shù)組、石杉堿甲組；測試學(xué)習(xí)和記憶成績；觀測海馬CA1區(qū)錐體細胞及頂樹突，透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：模型組學(xué)習(xí)和記憶成績降低（P＜0.05），且海馬CA1區(qū)錐體細胞數(shù)目也降低（P＜0.05），其頂樹突總長度顯著縮短，電鏡下超微結(jié)構(gòu)改變：細胞固縮，細胞膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜溶解線粒體嵴減少，核膜皺縮；石杉堿甲組學(xué)習(xí)和記憶成績均改善（P＜0.05），且海馬CA1區(qū)錐體細胞數(shù)目、頂樹突總長度也增加（P＜0.05）。結(jié)論：VD小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞細胞數(shù)目減少、樹突縮短、細胞器損害可能參與了VD的發(fā)病機制；石杉堿甲可以改善其形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變而改善臨床癥狀。

關(guān)鍵詞血管性癡呆 海馬 錐體細胞 透射電子顯微鏡 石杉堿甲

中圖分類號：R363.21；R965.1；R743.9 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1533(2011)09-0443-04

The morphology of neurons in vascular dementia

mouse hippocampus CA1 area and the effect of huperzine*

WANGWei-bin1，XU Cun-li1，LU Pei-yuan2

（1. Department of Neurology，Jining No.1 Hospital，Jining，272111；

2. Hebei Province People Hospital，Shijiazhuang，050051）

ABSTRACTObjective: To observe the their shape and ultrastructure change in neurons in the hippocampal CA1 area of the mice with vascular dementia (VD) and the influence of drugs (huperzine) enhancing intelligence. Methods: The models of VD were established with the shamed-operation group as control group and drug groups. The changes of behavior were observed. Then，the microcosmic changes of hippocampus were observed under microscopy，neurons of CA1 section were counted comparatively and the total length of apical dendrites were measured. The ultrastructure change of hippocampal CA1 pyramidal neurons was observed under transmission electron microscopy (TEM). Results: The results of mouses learning and memory in model group were inferior (P＜0.05)；the results from drug group and shamed-operation group had no significant difference. The neurons in hippocampus CA1 section of model group were reduced distinctly (P＜0.05)，the total length of apical dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons was shortened (P＜0.05)，but medicine group ameliorated apparently (P＜0.05). Ultrastructure of hippocampus CA1 section in neurons of model group changed as follows: the multivesicular bodies and mitochondria were severely damaged，their chromatins condensated，and the perinuclear endoplasmic reticulum were damaged apparently. The ultrastructure of hippocampus CA1 section of drug group and shamed-operation group had no significant difference.Conclusion: Decrease of neurons，the shortness of the total length of apical dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons，damage of multivesicular bodies and mitochondria in hippocampus CA1 section might also participate in the pathogenesis of VD，but huperzine could meliorate these changes and then alleviate the clinical symptom.

KEY WORDSvascular dementia；hippocamppus；pyramidal neuron；transmission electron microscopy ；huperzine

隨著高齡人口和腦卒中存活率的增高，血管性癡呆（vascular dementia，VD）的發(fā)病愈來愈多。腦卒中后出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶等智能障礙的確切發(fā)病機制尚不十分清楚。近年來，國內(nèi)外有資料[1]表明：VD的學(xué)習(xí)和記憶功能障礙與海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的丟失有關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)受損神經(jīng)元的細胞凋亡或遲發(fā)性壞死。海馬CA1區(qū)是參與學(xué)習(xí)和記憶形成的重要部位，因此，研究海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化對于了解VD的發(fā)病機制具有重要意義。本文采用神經(jīng)元的特殊染色技術(shù)和透射電子顯微鏡技術(shù)，探討VD海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化；同時觀察石杉堿甲對VD海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，以進一步探討石杉堿甲的藥理學(xué)機制。

1材料與方法

1.1動物模型制備與分組

實驗動物選用2月齡雄性昆明小鼠（購自河南華興實驗動物養(yǎng)殖中心，合格證號：醫(yī)動字第19-052號），體重（32±2） g。采用以往報告[2]雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎再灌注，3次缺血（ischemia，I）20 min、再灌注（reperfusion，R）10 min的方式（即I 20 min-R 10 min-I 20 min-R 10 min-I 20 min），并同時在小鼠尾尖1 cm處斷尾放血0.3 mL制備VD模型（n =16）；假手術(shù)組作為對照（n =23），僅暴露雙側(cè)頸總動脈而不結(jié)扎、不尾部放血；治療組（n =22）先制備模型，術(shù)后第2天經(jīng)胃管予石杉堿甲0.05 μg/(g·d)×30 d，每日1次；同時模型組、假手術(shù)組予生理鹽水0.01 mL/(g·d)×30 d。

1.2學(xué)習(xí)、記憶成績測試

術(shù)后第29天，各組分別進行跳臺試驗、水迷宮試驗，測試學(xué)習(xí)成績；術(shù)后第30天測試記憶成績。

1.2.1跳臺試驗

跳臺試驗裝置為被動回避反應(yīng)箱（YL-2藥理試驗儀，蚌埠無線電二廠），選擇電壓為AC、40V，通電時間5 min，記錄動物首次找到安全區(qū)所需時間(反應(yīng)時間)、動物跳下圓臺次數(shù) (錯誤次數(shù))作為學(xué)習(xí)測試成績。24 h后重復(fù)上述實驗，作為記憶測試成績（潛伏時間及錯誤次數(shù)）。

1.2.2水迷宮試驗

采用小鼠水迷宮試驗裝置（LW-Ⅱ型，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所），盲端有自動感應(yīng)裝置，自動控制記錄儀記錄數(shù)據(jù)。水深20 cm、水溫（22±1） ℃，記錄時間3 min。記錄其游完全程的時間、進入盲端次數(shù)作為學(xué)習(xí)測試成績。24 h后重復(fù)測試上述指標(biāo)作為記憶成績。

1.3標(biāo)本取材

術(shù)后第30天取材。用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g體重）麻醉小鼠；經(jīng)心灌注37 ℃生理鹽水50～100 mL，再灌注含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液（0.1 mol/L， pH 7.2）100～400 mL，30 min灌注完畢。取出整腦，在上述固定液內(nèi)浸泡12 h。電鏡樣品制備時，還需在上述固定液中加入戊二醛，使其濃度為2.5%。

1.4海馬CA1區(qū)錐體細胞計數(shù)

將小鼠左側(cè)腦組織常規(guī)石蠟包埋，在視交叉和乳頭體之間等間隔取3張冠狀面切片，片厚6 μm。切片采用Nissl染色，具體方法為：切片脫蠟至水，蒸餾水洗；加1%甲苯胺藍水溶液后置于54 ℃溫箱內(nèi)浸染25 min；蒸餾水稍洗，95%乙醇分化30 s；無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。光鏡下（×400）選取細胞數(shù)較為恒定的CA1區(qū)中段，采用雙盲法計數(shù)，每張切片取連續(xù)的兩個視野，并保證錐體細胞層的弧度弦置于目鏡的直徑上，取兩視野的平均值為該切片錐體細胞數(shù)，3張切片的平均值為該樣本的錐體細胞數(shù)。

1.5海馬CA1區(qū)錐體細胞頂樹突總長度測定

取小鼠右側(cè)腦組織視交叉與乳頭體之間，采用Golgi染色法，具體步驟為：蒸餾水沖洗20 min后置于37 ℃溫箱內(nèi)用3%重鉻酸鉀溶液媒染3 d，每天換液1次；取出后用蒸餾水洗1 min，置于37 ℃溫箱內(nèi)用1.5%的硝酸銀浸染3 d，每天換液1次；取出后蒸餾水洗7 min，制作冠狀面的石蠟切片，片厚20 μm；經(jīng)二甲苯脫蠟后，直接封片觀察。每一樣本選取3張切片，錐體細胞頂樹突總長度和一級樹突直徑測定方法參照Magarinos等[2]方法，隨機分別選取符合條件的6個浸染的CA1區(qū)錐體細胞，利用圖像分析系統(tǒng)、Jandel SigmaScan Pro軟件，對錐體細胞的總長度進行測量，取其均值作為該樣本頂樹突總長度。頂樹突總長度是指樹突的起始部至其最高分支末端之間的最長距離。一級樹突直徑是指其分支點與胞體間中部之直徑。

1.6海馬CA1區(qū)錐體細胞超微結(jié)構(gòu)的觀察

取已固定的小鼠腦組織樣品，參照文獻[3]，在視交叉和乳頭體之間，于2%預(yù)冷的戊二醛溶液中，切取1 mm厚左右的海馬橫斷薄片，30 min后，再次在固定液中切?。? mm3的海馬CA1區(qū)小組織塊，繼續(xù)固定2 h；磷酸緩沖液沖洗后，用2%鋨酸固定1 h；梯度乙醇脫水，并同時用溶于70%乙醇中醋酸鈾進行塊染；置于苯二甲酸二丙烯脂浸透24 h；并以其包埋后，63 ℃聚合72 h；半薄切片定位海馬錐體細胞層后進行修塊，超薄切片；枸櫞酸鉛染色后上鏡觀察并照相。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X ± S）表示，用SAS 6.0統(tǒng)計軟件單因素方差分析，以SNK法進行兩組之間的均數(shù)比較。

2結(jié)果

2.1跳臺試驗

結(jié)果見表1，從中可見模型組的學(xué)習(xí)成績和記憶成績均劣于假手術(shù)組（P＜0.05），石杉堿甲組的學(xué)習(xí)成績和記憶成績均優(yōu)于模型組（P＜0.05），而石杉堿甲組與假手術(shù)組間無明顯差別（P＞0.05）。

2.2水迷宮試驗

結(jié)果見表2，可見模型組的學(xué)習(xí)成績和記憶成績均劣于假手術(shù)組（P＜0.05），石杉堿甲組的學(xué)習(xí)成績和記憶成績均優(yōu)于模型組（P＜0.05），而石杉堿甲組與假手術(shù)組間無明顯差別（P＞0.05）。

2.3海馬錐體細胞計數(shù)

假手術(shù)對照組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列整齊且密集，胞漿中尼氏體豐富。模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列稀疏，細胞間隙增大，許多錐體細胞胞漿內(nèi)尼氏體減少或消失。藥物治療組較模型組有所改善，小鼠海馬錐體細胞排列尚整齊、密集，胞漿中尼氏體尚存在。在高倍鏡視野下（×400）的錐體細胞數(shù)比較結(jié)果見表3。經(jīng)計數(shù)發(fā)現(xiàn)，模型組海馬CA1區(qū)錐體細胞數(shù)顯著少于假手術(shù)對照組（P＜0.01）；而藥物治療組較模型組顯著增加（P＜0.01），與假手術(shù)對照組之間無明顯差別（P＞0.05）。

2.4海馬錐體細胞頂樹突總長度

表4為3組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞頂樹突總長度的結(jié)果，可見模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞頂樹突總長度較假手術(shù)對照組顯著縮短（P＜0.01）。藥物治療組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞頂樹突總長度較模型組顯著增長（P＜0.01）。并且，藥物治療組與假手術(shù)對照組之間，錐體細胞頂樹突總長度無明顯差別（P＞0.05）。

2.5海馬錐體細胞超微結(jié)構(gòu)的變化

電鏡下，假手術(shù)對照組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞超微結(jié)構(gòu)正常。模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞可見以下超微結(jié)構(gòu)的改變：細胞固縮、體積縮小，細胞膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜溶解，胞漿凝固、密度增高，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)模糊不清，線粒體嵴減少、模糊并見空泡樣變性，核膜呈波浪狀皺縮。藥物治療組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞超微結(jié)構(gòu)接近正常，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷均不明顯。

3討論

海馬是大腦的一個重要結(jié)構(gòu)，在學(xué)習(xí)和記憶功能中起著重要作用，也是大腦具有可塑性和極易受損的一個腦區(qū)，對缺血、缺氧極為敏感[4]。1934年，Lorente de No根據(jù)海馬細胞構(gòu)造及纖維聯(lián)系不同，將海馬結(jié)構(gòu)中的海馬本體部分區(qū)分為CA1～CA4這4個亞區(qū)，其中CA1區(qū)錐體細胞的樹突與來自內(nèi)嗅區(qū)的傳入纖維建立突觸聯(lián)系；而內(nèi)嗅區(qū)是多種神經(jīng)沖動進入海馬結(jié)構(gòu)前的整合區(qū)，也是海馬與其它皮質(zhì)建立聯(lián)系的中繼站。此外，CA1區(qū)錐體細胞的頂樹突分支廣泛、富有側(cè)棘，在海馬組織輻射層、腔隙層和分子層中與其它來源的纖維建立突觸聯(lián)系[5]。近期發(fā)現(xiàn)，海馬CA1區(qū)是反復(fù)腦缺血致累積性損害最為敏感的區(qū)域[6]。因此，我們選取海馬結(jié)構(gòu)CA1區(qū)神經(jīng)細胞，觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

在試驗中，我們發(fā)現(xiàn)VD小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)目減少、錐體細胞頂樹突總長度縮短，與其學(xué)習(xí)和記憶成績降低相一致。可能是該變化引起海馬結(jié)構(gòu)CA1區(qū)與其它部位的突觸聯(lián)系減少或突觸聯(lián)系中斷，從而導(dǎo)致神經(jīng)細胞突觸可塑性降低。但是，長時程增強（long term potentiation， LTP）是依賴于突觸可塑性的突觸聯(lián)系的數(shù)目增多或功能增強[7]。因此，該變化不利于LTP的形成。另外，海馬部位神經(jīng)細胞數(shù)目的減少可以引起神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增生，導(dǎo)致海馬硬化 [8]。

至于VD小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)目減少和錐體細胞頂樹突總長度縮短的原因，可能與缺血、缺氧引起的繼發(fā)性變化有關(guān)。在試驗中，我們也發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)錐體細胞內(nèi)尼氏物質(zhì)減少或消失，而尼氏物質(zhì)是神經(jīng)細胞合成蛋白質(zhì)的場所。在電鏡中也發(fā)現(xiàn)VD小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞固縮、體積縮小，細胞膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜溶解，胞漿凝固、密度增高，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)模糊不清，線粒體嵴減少、模糊并見空泡樣變性，核膜呈波浪狀皺縮，從而影響其形態(tài)結(jié)構(gòu)的維持。因為缺血、缺氧可以引起神經(jīng)細胞內(nèi)能量障礙而導(dǎo)致其超微結(jié)構(gòu)損害[9]。并且，缺血、缺氧也可以引起神經(jīng)細胞內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致其細胞器損傷和遲發(fā)性神經(jīng)元壞死[10]。

經(jīng)過長期石杉堿甲的治療，VD小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)目增多，錐體細胞頂樹突總長度增長，與假手術(shù)組無明顯差別，該變化與其學(xué)習(xí)和記憶功能改善相一致。并且，其超微結(jié)構(gòu)得到明顯改善。至于該藥理機制的原因，目前尚未明確，可能與石杉堿甲具有非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑作用、抑制缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)細胞內(nèi)鈣超載、改善其鈣穩(wěn)態(tài)平衡有關(guān)[11]。石杉堿甲可能下調(diào)細胞凋亡基因（c-fos、c-jun）表達，抑制缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)細胞凋亡或遲發(fā)性神經(jīng)元壞死[12]。石杉堿甲也可能改善通道，直接改善海馬神經(jīng)細胞突觸可塑性，易化LTP[13]?？傊?，石杉堿甲具有改善VD小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的新藥理學(xué)機制。

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（收稿日期：2011-05-19）