摘 要 目的：探討來氟米特對膠原性關(guān)節(jié)炎中免疫抑制性CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用。方法：II型膠原誘導(dǎo)Wistar大鼠，建立膠原性關(guān)節(jié)炎模型；檢測關(guān)節(jié)炎大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評分，每周2次；流式細(xì)胞儀檢測脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例；RT-PCR檢測脾淋巴細(xì)胞中Foxp3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，來氟米特（2 mg/kg，灌胃給藥15 d）明顯降低CIA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評分。與關(guān)節(jié)炎模型組比較，藥物干預(yù)組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例升高，轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA的表達(dá)增高。結(jié)論：來氟米特具有抑制關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹的作用，該作用可能和促進(jìn)CD4+CD25+Treg產(chǎn)生和增加Foxp3的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞關(guān)節(jié)炎 來氟米特 CD25

中圖分類號：R392.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1533(2011)11-0548-03

Effect of leflunomide on CD4+CD25+ regulatory T cells in collagen-induced arthritis rats*

WANG Ting-yu1，LI Jun2，JIN Zhi-gui1，WU Fei-hua1，JIN Jian1，TANG Ting-ting3，4

（1. Department of Pharmacy，Shanghai Ninth People’ s Hospital，School of Medicine at Shanghai Jiao Tong University，Shanghai，200011；2. School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei，230032；3. Shanghai Key Laboratory of Orthopaedic Implant，Shanghai，200011；4. Department of Orthopaedic Surgery，Shanghai Ninth People’ s Hospital，School of Medicine at Shanghai Jiao Tong University，Shanghai，200011）

ABSTRACTObjective: To investigate the effect of leflunomide on the immunosuppressive CD4+CD25+ regulatory T cells (CD4+CD25+ Tregs) in collagen-induced arthritis (CIA). Methods: CIA was induced by collagen type II in Wistar rats. Polyarthritis indexes were checked twice a week. Immunofluorescence flow cytometry and RT-PCR were used to determine the proportion of CD4+CD25+ Tregs and the expression of Foxp3 mRNA in the splenocytes of CIA rats，respectively. Results: Leflunomide (2 mg/kg，ig×15 days，day 10-24) could significantly decrease the polyarthritis indexes in CIA rats. Compared with model CIA rats，administration of leflunomide could significantly increase the number ofCD4+CD25+ Tregs and the expression of Foxp3 mRNA in spleen lymphocytes of CIA rats. Conclusions: The results demonstrated that the inhibition of arthritis by leflunomide was related to changes in CD4+CD25+ Tregs.

KEY WORDSarthritis；leflunomide；CD25

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）存在著持續(xù)性滑膜炎癥及進(jìn)展性軟骨和骨破壞，是一種炎性、自身免疫性疾病。來氟米特是一種疾病調(diào)修藥物，廣泛應(yīng)用于RA的治療[1]。動物實驗研究表明，來氟米特能抑制足趾腫脹和關(guān)節(jié)破壞[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，來氟米特能夠延緩RA疾病進(jìn)展、改善患者的癥狀、提高患者的生活質(zhì)量[1]。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+ regulatory T cells， CD4+CD25+Tregs)是一種免疫抑制性T細(xì)胞，其表面高表達(dá)CD25（IL -2Rα），占外周血CD4+ T細(xì)胞的5%~10％[3]。大量動物實驗結(jié)果證實，CD4+CD25+Tregs在維持自身免疫耐受和預(yù)防自身免疫性疾病中起著關(guān)鍵作用[4]。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3特異性表達(dá)于CD4+CD25+ Tregs[5]，使之區(qū)別于活化的CD4+ T細(xì)胞。Foxp3的表達(dá)對于CD4+CD25+Tregs的產(chǎn)生和功能維持是必要的，是CD4+CD25+Tregs的特異性標(biāo)志物之一。

鑒于來氟米特的免疫抑制性和CD4+CD25+Tregs的重要作用，本文將研究來氟米特對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠CD4+CD25+Tregs的影響，探討來氟米特是否通過上調(diào)CIA大鼠體內(nèi)的CD4+CD25+Tregs、從而抑制大鼠體內(nèi)過度增殖的T淋巴細(xì)胞并最終抑制關(guān)節(jié)炎癥的。

1材料和方法

1.1主要藥物及試劑

來氟米特由美國欣凱公司上海代表處提供；II型膠原（CII）、弗氏不完全佐劑（IFA）購于Sigma公司；小鼠抗大鼠FITC-CD4抗體、小鼠抗大鼠PE-CD25抗體及同型對照購于Caltag公司；Trizol reagent購于Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega公司。

1.2膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立

Wistar大鼠30只，體重(110±20) g，隨機(jī)分成正常組、CIA模型組和來氟米特用藥組。將CII溶入0.1 mol/L的乙酸中配成2 g/L，4 ℃攪拌過夜，與等體積IFA混合，充分乳化。將乳劑0.5 ml分多點(diǎn)注射至大鼠背部皮內(nèi)，1周后同法繼續(xù)注射。正常組大鼠注射等量生理鹽水。第10~24天，用藥組灌胃給予2 mg/kg來氟米特，正常組和模型組給予等體積生理鹽水。

1.3藥效學(xué)評價

采用多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)評價來氟米特對CIA大鼠的治療作用。

1.4CD4+CD25+ T細(xì)胞的檢測

致炎后第35天，股動脈放血處死大鼠，無菌制備大鼠脾淋巴細(xì)胞懸液（1×106/ml），加入FITC-CD4和PE-CD25抗體，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌后上流式細(xì)胞儀檢測，計算CD4+CD25+ T細(xì)胞占CD4+ T細(xì)胞的比例。

1.5Foxp3 mRNA的檢測

采用Trizol 法提取脾淋巴細(xì)胞總RNA，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

Foxp3上游：5’ - TAATATGCGGCCCCCTTTCACCTA -3’；Foxp3下游：5’ - GGCCCCCGTCCATGTTTTCTTG -3’。

β-actin上游：5’ - GATATCGCTGCGCTCGTCGTC -3’；β-actin下游：5’ - GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG -3’。

PCR擴(kuò)增35個循環(huán)，PCR 產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料數(shù)據(jù)以x±SEM表示，組間比較采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件中One-Way ANOVA分析。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1來氟米特對CIA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評分的影響

與正常組比較，CIA模型組大鼠造模10 d后大鼠關(guān)節(jié)腫脹度顯著增加，肢體持續(xù)紅腫，逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形。來氟米特（2 mg/kg）可明顯抑制CIA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)（表1）。

2.2來氟米特對CIA大鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+ T細(xì)胞的影響

結(jié)果如圖1所示，與正常組相比，CIA組CD4+CD25+ T細(xì)胞的比例明顯降低。來氟米特能明顯提高CIA大鼠CD4+CD25+ T細(xì)胞的比例。

2.3來氟米特對CIA大鼠脾淋巴細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)的影響

與正常組相比，CIA大鼠脾淋巴細(xì)胞中Foxp3 mRNA的表達(dá)明顯降低，來氟米特可明顯提高CIA大鼠脾淋巴細(xì)胞中Foxp3 mRNA的表達(dá)（圖2）。

3討論

疾病調(diào)修藥來氟米特在臨床上被廣泛用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療，其作用機(jī)制可能與抑制淋巴細(xì)胞的活性有關(guān)[6]，但是具體機(jī)制未明。本文選取多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)進(jìn)行評估，結(jié)果表明來氟米特能明顯減少CIA大鼠的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評分，說明來氟米特對CIA大鼠的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎具有治療作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Tregs對自身反應(yīng)性T細(xì)胞的抑制作用在維持自身免疫耐受中起著關(guān)鍵作用。Gonzalez-Rey 等[7]發(fā)現(xiàn)，血管活性腸肽治療CIA與其促進(jìn)CD4+CD25+Tregs的產(chǎn)生有關(guān)，清除小鼠體內(nèi)的CD4+CD25+Tregs有利于關(guān)節(jié)炎的形成[8]。抗TNF-α抗體通過抑制炎癥上調(diào)功能性CD4+CD25+Tregs[9]。本文中，我們發(fā)現(xiàn)CIA大鼠體內(nèi)CD4+CD25+Tregs數(shù)量降低。CD4+CD25+Tregs數(shù)量不足，引起CD4+CD25+Tregs的免疫抑制功能不足，導(dǎo)致CIA大鼠體內(nèi)Th1細(xì)胞所致的免疫反應(yīng)作用增強(qiáng)，最終致使CIA大鼠體內(nèi)免疫功能失調(diào)，關(guān)節(jié)炎癥持續(xù)存在。來氟米特灌胃給予CIA大鼠后能明顯提高CIA大鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+ T細(xì)胞的比例。來氟米特治療CIA可能與其提高CIA大鼠CD4+CD25+Tregs的數(shù)量有關(guān)。

Foxp3基因最初是在Scurfy小鼠中發(fā)現(xiàn)的，小鼠Foxp3基因位于染色體XA1.1，全長30 858 bp，編碼蛋白含431個氨基酸。人Foxp3基因位于染色體Xp11.23，有11個外顯子，編碼一個48 kD的蛋白Scurfin。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3選擇性表達(dá)于CD4+CD25+Tregs，是CD4+CD25+Tregs的高度特異性標(biāo)記，直接參與CD4+CD25+Tregs的發(fā)育和功能維持。在CD4+CD25- T細(xì)胞中異位表達(dá)Foxp3能使其具有CD4+CD25+Tregs的表型和功能[10]。Valencia等[11]研究發(fā)現(xiàn)，給予RA患者抗TNF-α抗體治療后，患者CD4+CD25+Tregs中Foxp3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均提高，同時伴隨著CD4+CD25+Tregs抑制功能的提高。更重要的是，CD4+ T細(xì)胞活化后并不能誘導(dǎo)Foxp3的表達(dá)。因此，檢測Foxp3的水平能較真實地反映CD4+CD25+Tregs的水平和功能，是目前公認(rèn)的反映CD4+CD25+Tregs的“金標(biāo)準(zhǔn)”。我們用RT-PCR法檢測脾淋巴細(xì)胞中Foxp3 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明，CIA大鼠脾淋巴細(xì)胞中Foxp3 mRNA的表達(dá)明顯低于正常大鼠脾淋巴細(xì)胞中Foxp3 mRNA的表達(dá)。這與前面流式細(xì)胞術(shù)分析的脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+ T細(xì)胞的比例結(jié)果是一致的，說明CIA大鼠體內(nèi)CD4+CD25+Tregs的數(shù)量和功能均較正常大鼠降低。重要的是，給予CIA大鼠來氟米特治療后，其脾淋巴細(xì)胞中Foxp3 mRNA的表達(dá)顯著升高，同時伴隨著CD4+CD25+Tregs的數(shù)量提高。提示來氟米特能明顯提高CIA大鼠體內(nèi)CD4+CD25+Tregs的數(shù)量和功能，這可能是來氟米特治療CIA的新的作用機(jī)制。

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（收稿日期：2011-08-05）