張海鋒,何紅秋,劉 斌,楊 東,張小軼,譚建軍,陳慰祖,王存新

(基礎(chǔ)研究)

人免疫缺陷病毒-1p66蛋白在大腸埃希菌中低溫長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)和活性鑒定

張海鋒,何紅秋,劉 斌,楊 東,張小軼,譚建軍,陳慰祖,王存新

目的人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,H IV)-1逆轉(zhuǎn)錄酶是由 p66和 p51亞單位組成的異二聚體,抑制其活性可阻斷 H IV-1的復(fù)制,是治療獲得性免疫缺陷綜合征 (acquired immunodeficiency syndrome,A IDS)的重要靶點(diǎn)。獲得大量純化的 H IV-1 p66亞單位蛋白有助于研究其活性,為抗 H IV-1藥物研究提供藥物篩選平臺(tái)。文中構(gòu)建 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因的原核表達(dá)系統(tǒng),獲取高純度高活性的 H IV-1 p66亞單位重組蛋白。方法用 PCR從含 H IV-1 HXB2標(biāo)準(zhǔn)株全基因的質(zhì)粒中擴(kuò)增出編碼 H IV逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位的基因,通過(guò)酶切、連接等方法構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-28a(+)-p66,并轉(zhuǎn)化到宿主菌大腸埃希菌BL21(DE3)中,用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱親和層析純化后獲得 H IV逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位蛋白。結(jié)果所構(gòu)建了 pET-28a(+)-p66質(zhì)粒酶切片段為 1680 bp,測(cè)序符合 H IV逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位編碼基因序列。在 IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量為 66 000的 H IV逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位蛋白。結(jié)論 成功構(gòu)建了 pET-28a(+)-p66質(zhì)粒,具有較高的 H IV逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位蛋白表達(dá)效率及活性。

人免疫缺陷病毒;逆轉(zhuǎn)錄酶;原核表達(dá);純化

0 引 言

H IV感染可導(dǎo)致 A IDS。H IV進(jìn)入宿主細(xì)胞后在逆轉(zhuǎn)錄酶 (reverse transcriptase,RT)的作用下完成逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶具有 3種活性:RNA依賴的DNA聚合酶活性、DNA依賴的DNA聚合酶活性和 RNase H活性[1-2],催化 H IV-1的單股正鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄成為前病毒雙鏈 DNA。阻斷 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的活性可阻斷 H IV-1的復(fù)制,因此 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶是A IDS治療的重要靶點(diǎn)。

H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶是pol基因編碼產(chǎn)物的一部分,由 p66和 p51亞單位組成異二聚體。其中 p51亞單位是 p66亞單位 C末端 RNase H結(jié)構(gòu)域在蛋白酶切割后形成的產(chǎn)物。p66亞單位含兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域:聚合酶結(jié)構(gòu)域和 RNase H結(jié)構(gòu)域。p51亞單位只含有聚合酶結(jié)構(gòu)域,在 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶異二聚體中僅起輔助作用[3]。H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶 p66蛋白在感染細(xì)胞中表達(dá)含量很低。為了進(jìn)一步研究其生物學(xué)性質(zhì),為建立以逆轉(zhuǎn)錄酶為靶點(diǎn)的抗 H IV-1藥物篩選平臺(tái),必須在體外獲得大量純化的 H IV-1 p66亞單位蛋白。文內(nèi)采用大腸埃希菌 BL21(DE3)原核表達(dá)系統(tǒng),通過(guò)低溫長(zhǎng)時(shí)增加蛋白的可溶性,用鎳瓊脂糖凝膠載體純化,獲得大量可溶性 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的重組蛋白。

1 材料與方法

1.1 工具酶和試劑 質(zhì)粒 pET-28a(+)購(gòu)自 Novagen公司,限制性內(nèi)切酶和 T4 DNA連接酶購(gòu)自New England Biolabs公司,TaqDNA聚合酶購(gòu)自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司,PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司,質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司,E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、DNA及蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自天根生化科技有限公司,鎳瓊脂糖凝膠 FF購(gòu)自北京韋氏博慧色譜科技有限公司,InVisionTMHis-標(biāo)記膠內(nèi)染色試劑盒購(gòu)自 Invitrogen公司。

根據(jù)目的蛋白序列特點(diǎn),并參考 pET-28a(+)載體的多克隆酶切位點(diǎn)信息設(shè)計(jì)引物并引入N deI和BamH I雙酶切位點(diǎn)。所用引物設(shè)計(jì)、合成及p66基因擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。

1.2 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)H IV-1 HXB2p66基因讀碼框設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,上游引物:5′-CTG CAT ATG(NdeI位點(diǎn))CCCATT AGCCCT ATTG AGACTGTACC-3′,p66下游引物:5′-T ATGGATCC(BamHⅠ位點(diǎn))TT A(終止密碼子)TAGTACTTTCCTGATTC CAGC-3′。PCR產(chǎn)物為 1680 bp的全長(zhǎng)p66基因,切膠回收后以NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切,產(chǎn)物與經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切的 pET-28a(+)載體連接。將所獲 pET-28a(+)-p66質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中,用含 50μg/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選。挑取陽(yáng)性克隆,用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,進(jìn)行NdeI/BamH I雙酶切鑒定,對(duì)含有目的基因片段的克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白的表達(dá)和檢測(cè) 將測(cè)序正確的含有重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸埃希菌按 1%比例接種于含 50μg/ml卡那霉素的 SB培養(yǎng)基中,于37℃搖床 200 rpm培養(yǎng)至菌液 OD值達(dá) 0.6(600 nm),加入 IPTG至終濃度為 0.5mmol/L,于 25℃搖床 150 rpm誘導(dǎo) 24 h。收集菌體并用預(yù)冷的 PBS洗 1次,重懸于 pH 8.0含 0.3 g/L溶菌酶的平衡液 (20 mmol/L Tris,1 mol/L NaCl,10%甘油,2 mmol/Lβ-巰基乙醇,5 mmol/L咪唑,)中,反復(fù)凍融 3次并超聲破碎細(xì)菌 (超聲 8 s、間歇 8 s,50次,最大功率 400W),4℃離心半徑 97mm,8000 r/mm離心 30 min,收集上清液。經(jīng)過(guò)濾紙過(guò)濾后上樣于鎳瓊脂糖凝膠柱,分別用含 30、60、100、200 mmol/L咪唑的A液進(jìn)行梯度洗脫,收集洗脫液并進(jìn)行 SDS-PAGE分析(12%分離膠),用 InVisionTMHis-標(biāo)記膠內(nèi)染色試劑盒染色。鑒定含目的蛋白的洗脫液,按 1∶500用 PBS透析后備用。取離心后的上清和沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE。

1.4 重組 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白逆轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè) 用RT-PCR檢測(cè)制備的 H IV-1 P66蛋白的酶活性。用Trizol法從新鮮豬肝組織提取總 RNA。以提取的豬肝細(xì)胞基因組RNA為模板,豬血清白蛋白(pig serum albumin,PSA)基因的擴(kuò)增引物序列為:PSA-P1:5′-GCTCTAGATTCGAAACCATGAAGTGGG TG ACTTTTA-3′;PSA-P2:5′-CGGAATTCGGATCCACCACCACCGGCTAAGATC CCTCGAAT-3′。cDNA合成步驟如下[4-6]:將 2μl總RNA加入0.5ml ependoff管,再依次加入 4μl 25 mmol/L Mgcl2,0.8μl PS A-P2,2μl 10 mmol/L dNTP,2μl 10×AMV buffer,0.6μl AMV反轉(zhuǎn)錄酶或4μl重組H IV-1 P66蛋白,0.5μl重組Rasin核糖核酸酶抑制劑,最后加經(jīng)焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)處理過(guò)的雙蒸水至總體積為 20μl。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:42℃60min,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),95℃2min,逆轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積 100 μl,包括10μl cDNA溶液(逆轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA稀釋至100μl,取 10μl),特異性上下游引物各 0.5μl(100 μmol/L),1μlTaq Mix(2×),10μl 10×Taq Mixbuffer,加雙蒸水至100μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 5min, 94℃變性60 s,50℃退火50 s,72℃延伸120 s,循環(huán)擴(kuò)增30次;最后72℃延伸5min。RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié) 果

2.1 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因克隆和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用上、下游引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定表明,擴(kuò)增產(chǎn)物為 1680 bp的陽(yáng)性條帶,與已知 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶p66基因長(zhǎng)度一致,見(jiàn)圖 1。將 PCR產(chǎn)物與 pET-28a(+)載體連接后,挑選出 1個(gè)克隆,用p66引物進(jìn)行 PCR鑒定,PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定,與已知H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶p66基因序列一致。

圖 1 重組質(zhì)粒 pET-28a(+)-p66NdeⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定Figure 1 Restriction enzyme digestion analysis for pET-28a(+)-p66

2.2 重組 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位蛋白的 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)條件和產(chǎn)物鑒定 在 IPTG終濃度為 0.5 mmol/L、溫度 25℃、時(shí)間 24 h條件下,可溶性蛋白表達(dá)量最高,且在以后的純化過(guò)程中可避免變性復(fù)性步驟,減少蛋白活性丟失。含 100mmol/L咪唑的洗脫液可洗出大量目的蛋白。含有目的蛋白的收集液用PBS以 1∶500(v/v)透析 24 h。透析后的蛋白分裝保存于 -80℃。用 12%SDS-PAGE鑒定,經(jīng) InVisionTMHis-標(biāo)記膠內(nèi)染色試劑盒染色,在波長(zhǎng) 302 nm處檢測(cè)。表達(dá)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為66000,據(jù)此判斷為目的蛋白,見(jiàn)圖 2。

圖 2 重組 HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位蛋白的 SDS-PAGE結(jié)果Figure 2 12%SDS-PAGE analysis of the prote in expression and purification,the gel was sta ined by In-VisionTMHis-tag I n-gel Sta in

2.3 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白逆轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè) 用Trizol方法從新鮮豬肝組織中提取總 RNA。用所制備的重組 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶 p66亞單位對(duì)豬肝細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA,再用豬血清白蛋白基因的測(cè)序引物 PSA-P1和 PSA-P2進(jìn)行 RT-PCR,得到 1821 bp的擴(kuò)增片段。用 Promega公司提供的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)豬肝細(xì)胞總 RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后獲得同樣大小的擴(kuò)增片段,表明重組 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶具有生物活性,見(jiàn)圖 3。

圖3 RT-PCR活性檢測(cè)結(jié)果Figure 3 The activity result by RT-PCR

3 討 論

H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶 p66蛋白在體內(nèi)的表達(dá)量較低,因而研究較為困難,但該蛋白相對(duì)保守,現(xiàn)已在體外用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了 H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶 p66蛋白[7],但制備重組蛋白的過(guò)程中還存在一些問(wèn)題,如標(biāo)簽無(wú)法去除[8],純化步驟復(fù)雜,真核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白活性與原核系統(tǒng)相比較低。本研究采用了原核系統(tǒng) pET-28a(+)表達(dá)載體,由于 pET-28a(+)載體表達(dá)的重組蛋白帶有可與鎳瓊脂糖凝膠特異結(jié)合的 His標(biāo)簽,高濃度咪唑可將與鎳瓊脂糖凝膠柱結(jié)合的目的蛋白洗脫,從而簡(jiǎn)化了純化步驟,一步性完成純化過(guò)程。

柯越海等[9]以包涵體形式表達(dá)純化的 p66蛋白,蛋白純化過(guò)程中須對(duì)包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性,操作復(fù)雜且耗時(shí)費(fèi)力。包涵體變性后蛋白質(zhì)復(fù)性效率不高,會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊或不折疊,影響純化后 p66蛋白的功能活性。本研究采用低溫過(guò)夜誘導(dǎo) p66蛋白表達(dá),從圖 2可見(jiàn)。從破碎細(xì)胞上清液中純化的p66蛋白含量高于從沉淀中純化的蛋白量,表明低溫長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)可使 p66蛋白表達(dá)量明顯提高。

1989年,齊多夫定 (zidovudine,AZT)獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市用于艾滋病的治療,是第一個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)使用的抗艾滋病藥物。逆轉(zhuǎn)錄酶是抗 H IV藥物的重要靶點(diǎn),AZT就是以逆轉(zhuǎn)錄酶為靶點(diǎn)的 H IV抑制劑,是治療艾滋病的主要藥物。當(dāng)前廣泛使用的行之有效的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法 (highly active antiretroviral therapy,HAART,俗稱(chēng)雞尾酒療法)推薦使用至少1種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。隨著抗病毒藥物的廣泛使用,耐藥突變株的逐漸出現(xiàn),亟待發(fā)現(xiàn)新藥物來(lái)控制耐藥性病毒株[10]。H IV-1在人體內(nèi)的復(fù)制過(guò)程依賴逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶的相互作用[11],阻斷逆轉(zhuǎn)錄酶與整合酶的相互作用可有效地阻斷病毒在體內(nèi)的復(fù)制,以逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶的相互作用為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物篩選將成為今后的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了以 gp41蛋白和整合酶為靶點(diǎn)的藥物篩選平臺(tái)[12]。本研究獲得了純化的 p66蛋白,表達(dá)的 H IV-1 p66蛋白經(jīng)鑒定具有體外逆轉(zhuǎn)錄酶活性,為研究整合酶與逆轉(zhuǎn)錄酶的相互作用并以這種相互作用為靶標(biāo)進(jìn)行研究提供了材料。本研究也有助于進(jìn)一步研究逆轉(zhuǎn)錄酶與整合酶的相互作用。

[1] De Clercq E.HI V inhibitors targeted at the reverse transcriptase [J].A IDS Res Hum Retroviruses,1992,8(2):119-134.

[2] KatiWM,Johnson KA,Anderson KS,et al.Mechanis m and fidelity of H IV reverse transcriptase[J].J Biol Chem,1992,267 (36):25988-25997.

[3] ZhengXH,Mueller GA,London RE,et al.Homodimerization of the p51 subunit of H IV-1 reverse transcriptase[J].Biochemistry,2010,49(13):2821-2833.

[4] 吳 陽(yáng),李晨陽(yáng),王歲樓.豬血清白蛋白基因的克隆與序列分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,28(3):33-36.

[5] 鄧興力,楊智勇,徐 丹,等.人神經(jīng)生長(zhǎng)因子β基因克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2009,22 (1):108-110.

[6] 孫守勛,李 強(qiáng),石 妍,等.人 Toll樣受體 2細(xì)胞外區(qū)基因重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建及鑒定[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào), 2009,22(2):120-123.

[7] Kawa S,KumarA,Smith JS.Expression and purification of the H IV-1 reverse transcriptase using the baculovirus expression vector system[J].Protein Exp Purif,1993,4(8):298-303.

[8] Hou EW,Prasad R,BeardWA.High level expression and purification of untagged and histidine tagged H IV-1 reverse transcriptase[J].Protein Exp Purif,2004,34(1):75-86.

[9] 柯越海,汪家權(quán),曾 毅.重組 H IV-1轉(zhuǎn)錄酶的純化與活性研究[J].病毒學(xué)報(bào),1998,14(4):513-123.

[10] 程紹輝,何紅秋,王存新,等.磁珠分離DNA技術(shù)檢測(cè)H IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因耐藥性突變[J].中國(guó)生物工程雜志,2008, 28(8):105-109.

[11] Tasara T,Maga G,HübscherU.H IV-1 reverse transcriptase and integrase enzymes physically interact and inhibit each other[J]. FEBSLetters,2000,507(1):39-44.

[12] He HQ,Ma XH,Wang CX,et al.A novel high-throughput format assay for H IV-1 integrase strand transfer reaction using magnetic beads[J].Acta Pharmacol Sin,2008,29(3):397-404.

Purification of human immunodeficiency virus-1 p66 protein expressed at low temperature and long-t ime induction and the identification of its biological activity

ZHANG Hai-feng,HE Hong-qiu,L IU Bin,YANG Dong,ZHANG Xiao-yi,TAN Jian-jun,CHEN Wei-zu, WANG Cun-xin
(College of L ife Science and B ioengineering,Beijing University of Technology,Beijing100124,China)

ObjectiveReverse transcriptase,a heterodimer composed of subunits p66 and p51,is considered as an important target forA IDS therapy.H IV-1 replication can be blocked by inhibition of the reverse transcriptase activity.The obtainmentof purified H IV-1 p66 protein will help to study its activity and develop a screening assay for anti-H IV-1 drugs.In the present study,we constructed a p66 prokaryotic expression plas mid,and obtained highly pure and active H IV-1 p66 recombinant protein. Methods The sequence encoding H IV-1 p66 protein was amplified by PCR from the plasmid containing the H IV-1 HXB2 genome,and then cloned into the pET-28a(+)vector by restriction enzyme digestion and ligation to construct the prokaryotic expression plasmid pET-28a(+)-p66.Then itwas transfor med intoE.coliBL21(DE3)strain.IPTGwas used to induce the expression of p66.Finally,nickel affinity gelwas used to purify the p66 protein.ResultsA 1680 bp fragmentwas identified by restriction enzyme digestion.The sequencing result indicated that the H IV-1 p66 gene was cloned into pET-28a(+)correctly.ConclusionThe prokaryotic expression plas mid pET-28a(+)-p66 was constructed successfully.Highly expressed and active H IV-1 p66 recombinant protein was obtained.

Human immunodeficiency virus;Reverse transcriptase protein;Prokaryotic expression;Purification

R446.62

A

1008-8199(2011)02-0139-04

國(guó)際科技合作計(jì)劃 (2010DFA31710);北京市自然科學(xué)基金(7082006)

100124北京,北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院[張海鋒(理學(xué)碩士研究生)、何紅秋、劉 斌、楊 東、張小軼、譚建軍、陳慰祖、王存新]

王存新,E-mail:cxwang@bjut.edu.cn

2010-10-26;

2010-11-30)

(責(zé)任編輯:齊 名;英文編輯:郭聯(lián)慶)