劉齊，劉愛(ài)紅，孫美玲，李孚杰

(湖北大學(xué)知行學(xué)院，生物工程系，湖北武漢，430011)

嗜酸乳桿菌胞外多糖提取工藝優(yōu)化

劉齊，劉愛(ài)紅，孫美玲，李孚杰

(湖北大學(xué)知行學(xué)院，生物工程系，湖北武漢，430011)

微 生物的胞外多糖是微生物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞壁外的黏液多糖或莢膜多糖，是具有增稠和膠體性質(zhì)并能溶解或分散在水中的長(zhǎng)鏈、高分子聚合物。試驗(yàn)以嗜酸乳桿菌胞外多糖為研究對(duì)象，對(duì)提取時(shí)間、提取的乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取的料液比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并利用sas軟件對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到在80%體積分?jǐn)?shù)的乙醇下，以1∶1.8(體積比)的料液比抽提12 h，得到的多糖的產(chǎn)量為1.91 g/L。

嗜 酸乳桿菌，胞外多糖，提取工藝，優(yōu)化

近年來(lái)，由于細(xì)菌發(fā)酵多糖具有安全無(wú)毒、結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)不受地域和病蟲(chóng)害限制等優(yōu)點(diǎn)而日益受到人們的廣泛關(guān)注［1－2］。目前，在世界范圍內(nèi)微生物多糖產(chǎn)量的年增長(zhǎng)率維持在10%左右，主要以絮凝劑、懸浮劑的形式應(yīng)用于食品、制藥和化工等多個(gè)領(lǐng)域［9］，同時(shí)也有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)菌胞外多糖在抑制腫瘤的產(chǎn)生方面有明顯的效果，這更加大和拓寬了細(xì)菌胞外多糖的功能性應(yīng)用。

與真菌多糖比較，嗜酸乳桿菌胞外多糖在改變?nèi)芤旱牧髯儬顟B(tài)上有許多優(yōu)勢(shì)。例如，在低濃度的狀態(tài)下，能有效增加溶液的黏性同時(shí)又不會(huì)形成凝膠;在很小的切應(yīng)力作用下就能夠增加溶液的流動(dòng)性，而當(dāng)外界切應(yīng)力消失的時(shí)候，又能回復(fù)原本的黏度等等。嗜酸乳桿菌胞外多糖不僅對(duì)乳制品的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味具有重要影響，而且有可能成為食品級(jí)多糖的一個(gè)極好的來(lái)源而廣泛應(yīng)用于各種食品的增稠、穩(wěn)定、乳化、膠凝及保濕［4－5］。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)嗜酸乳桿菌胞外多糖提取工藝中可能產(chǎn)生的影響因素為研究對(duì)象，以提取料液比、提取溫度和提取液濃度這3個(gè)不同的因素對(duì)嗜酸乳桿菌胞外多糖的分離提取做優(yōu)化試驗(yàn)，建立模擬方程，同時(shí)對(duì)提取分離出來(lái)的多糖進(jìn)行初步分析，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)［13－14］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)，實(shí)驗(yàn)室分離，保存。95%乙醇(AR)，無(wú)水乙醇(AR)，濃硫酸(AR)，葡萄糖(AR)，重蒸苯酚(AR)，透析帶，MRS培養(yǎng)基［12］、DEAE-Cellulose 52、Sephadex G-200。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-7504紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司;CS101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備制造廠;超速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman，恒溫水浴鍋、磁力攪拌器、偷襲帶、冷凍干燥器、氣相色譜、核算蛋白檢測(cè)儀等。

1.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0.5 mL，1 mL，1.5 mL，2 mL，2.5 mL，3 mL于帶刻度的比色管中，用蒸餾水定容至20 mL，另取20 mL的蒸餾水于帶刻度的比色管中作為空白樣，分別在各比色管中加入5 mL 5%的苯酚溶液，搖勻后立即在每個(gè)比色管中分別加入25 mL濃硫酸，用力振蕩，沸水浴放置2 h，于490 nm處進(jìn)行吸光值的檢測(cè)，每個(gè)試樣測(cè)定5次，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)EXCEL分析得到葡萄糖濃度與吸光度值A(chǔ)間的回歸方程［6］。

1.4 嗜酸乳桿菌胞外多糖提取單因素試驗(yàn)

先利用 95%的乙醇分別按照 1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5(體積比)的料液比例提取24h，在其他提取條件不變的情況下進(jìn)行分離提取，分析胞外多糖產(chǎn)量。然后以乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%，料液比為1∶3(體積比)，分別抽提6，15，25，35和 45 h，測(cè)定胞外多糖含量。最后分別按照50%，60%，70%，80%，95%的乙醇體積分?jǐn)?shù)，按1∶3(體積比)的料液比抽提24 h，測(cè)定胞外多糖含量。

1.5 嗜酸乳桿菌胞外多糖的提取優(yōu)化方法

將嗜酸乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h［10］，將嗜酸乳桿菌胞外多糖的發(fā)酵液按旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)分別給予的不同提取溫度、料液比和時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)。測(cè)定最后多糖含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，每次3個(gè)平行取平均值。

1.6 分析方法

經(jīng)發(fā)酵得到的發(fā)酵液，通過(guò)低溫高速離心機(jī)在12 000 r/min(4℃)條件下離心30 min，取上清液，按照試驗(yàn)規(guī)定的條件利用乙醇沉淀，將上清液再次于低溫高速離心機(jī)中以12 000 r/min(4℃)條件離心30 min，離心得到的沉淀物和酒精沉淀一同歸并溶于蒸餾水中，4℃條件下透析48 h。對(duì)該溶液采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量。

1.7 分離純化

將上述得到的粗多糖使用規(guī)格為1.6 cm×60 cm離子交換柱(DEAE-Cellulose 52)分離純化，分離條件為:上樣濃度0.3 g/L，上樣體積 1 mL，利用0.1mol/L的NaOH溶液洗脫，流速為10 mL/h，采用分步收集方式，每管收集1.5 mL，利用苯酚硫酸法檢測(cè)多糖含量并將其中含量較高成分冷凍干燥備用。將含量較高的成分收集起來(lái)，利用Sephadex G-200進(jìn)行分離純化。柱子規(guī)格1.6 cm×60 cm、上樣濃度為10 mg/mL，用蒸餾水洗脫，上樣體積為1 mL，流速為10 mL/h，每管收集1.5 mL，苯酚硫酸法和核酸蛋白儀跟蹤檢測(cè)獲得組分A，并且冷凍干燥留作分析備用。

1.8 組分A的氣相分析

將上述分析得到的含量最多組分A進(jìn)行相應(yīng)前處理，在 HT-5，30 m ×0.32 mm ×0.25 μm 的分離柱下檢測(cè)分析。具體條件如下:

氣流速度為25 mL/min(N2∶H2∶空氣之比為1∶1.5∶20)。程序升溫:160 ～180 ℃，10 ℃/min，2 min;180～208℃ 3℃/min，2 min;208～210℃1℃/min，4 min。檢測(cè)器溫度:280℃。進(jìn)樣量為1 μL。以標(biāo)準(zhǔn)單糖分子氣相色譜圖為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)曲試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的濃度作為橫坐標(biāo)，在490 nm下吸光值(以0.2～0.8為有效數(shù)據(jù))為縱坐標(biāo)做圖，由分析軟件得到該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線形方程y=14.567x+0.003 9，同時(shí)其線性回歸系數(shù)R2為0.999 4。由此可以判定該標(biāo)準(zhǔn)曲線在吸光值0.2～0.8有很好的線性，能夠通過(guò)其精確計(jì)算出多糖產(chǎn)量。

2.2 嗜酸乳桿菌胞外多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)嗜酸乳桿菌胞外多糖提取效果的影響

在體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇體積分?jǐn)?shù)下以不同料液比提取24 h;料液比對(duì)胞外多糖提取的影響見(jiàn)圖1。從圖1多糖含量變化趨勢(shì)可以看出，當(dāng)提取多糖溶劑(酒精)濃度和抽提時(shí)間一定的情況下，嗜酸乳桿菌胞外多糖的含量在料液比為1∶3(體積比)之前隨著料液比的增大而增大，在料液比為1∶3(體積比)附近時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)，隨后伴隨料液比的增大其產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。因此選擇提取的料液比為1∶3(體積比)。

圖1 料液比對(duì)多糖提取的影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)嗜酸乳桿菌胞外多糖提取效果的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%，料液比為1∶3，時(shí)間對(duì)胞外多糖提取的影響見(jiàn)圖2。從圖2多糖含量變化趨勢(shì)可以看出，當(dāng)浸提時(shí)間在24 h之前多糖含量明顯增加，在24 h附近出現(xiàn)拐點(diǎn)，而在24 h之后趨近平緩。說(shuō)明當(dāng)料液比和浸提液(酒精)濃度確定之后，在浸提時(shí)間少于24 h的時(shí)候，多糖還沒(méi)有完全被浸提出來(lái)，而超過(guò)大約24 h之后，其基本抽提完全。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇浸提時(shí)間為24 h。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)多糖提取的影響

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)嗜酸乳桿菌胞外多糖提取效果的影響

在采用不同濃度的溶劑(乙醇)，以1∶3(體積比)的比例抽提24 h。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)胞外多糖的影響(圖3)。從圖3可以看出當(dāng)浸提時(shí)間和料液比一定時(shí)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%以下時(shí)，隨著濃度的增大，嗜酸乳桿菌胞外多糖的提取效果明顯增大，而超過(guò)70%以后其提取效果的增加幅度明顯減緩，最后趨于穩(wěn)定，維持在1.5 g/L左右。因此，考慮到整個(gè)提取過(guò)程中成本問(wèn)題，試驗(yàn)選取浸提乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖提取的影響

2.3 旋轉(zhuǎn)正交優(yōu)化嗜酸乳桿菌胞外多糖的提取工藝

2.3.1 三因子二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)采用3因素二次旋轉(zhuǎn)正交組合設(shè)計(jì)方案，以優(yōu)化提取工藝參數(shù)。將上述單因素試驗(yàn)所獲得的最佳值(料液比1∶3，浸提時(shí)間24 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)95%)為基礎(chǔ)，為每個(gè)試驗(yàn)因素選取5個(gè)水平進(jìn)行旋轉(zhuǎn)正交實(shí)驗(yàn)。旋轉(zhuǎn)正交實(shí)驗(yàn)水平設(shè)計(jì)如表1所示。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)如表2所示。

表1 因素水平編碼

表2 旋轉(zhuǎn)正交數(shù)據(jù)

通過(guò)sas軟件對(duì)旋轉(zhuǎn)正交實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出經(jīng)過(guò)不同提取方式得到的嗜酸乳桿菌胞外多糖產(chǎn)量(C)與乙醇體積分?jǐn)?shù)(X)、浸提時(shí)間(Y)和料液比(Z)的三元二次方程:C=1.092 734+0.323 974X+0.294 948Y+0.136 121Z+0.028 276X×X+0.030 059Y×X－0.386 224Y×Y－0.367 432Z×X+0.361 421Z×Y+0.189 776Z×Z。同時(shí)該方程擬合檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其F值為13.24，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于F0.01(9，13)=4.19。因此，可以認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)所完成的數(shù)學(xué)模型能夠很好的模擬酒精濃度、料液比、浸提時(shí)間對(duì)于整個(gè)嗜酸乳桿菌提取過(guò)程中的影響情況。

在該模擬方程中，可以清楚的看到 X、Y、Z、Y2、X×Z、Z×Y、Z2的P值都小于0.05，說(shuō)明這幾項(xiàng)之間存在顯著性差異，而其余幾項(xiàng)都不存在顯著性差異。也就是說(shuō)，乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時(shí)間、料液比、酒精濃度和料液比、浸提時(shí)間和料液比的交互作用對(duì)于整個(gè)抽提過(guò)程存在有較大的影響。為了方便分析和優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)將公式簡(jiǎn)化為如下形式:

C=1.092 734+0.323 974X+0.294 948Y+0.136 121Z+0.189 776Z×Z－0.367 432Z×X+0.361 421Z ×Y。

表3 方程中各參數(shù)的回歸系數(shù)

表4顯示在乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、抽提時(shí)間這3個(gè)因素中，對(duì)于嗜酸乳桿菌胞外多糖的影響顯著性次序應(yīng)當(dāng)是:料液比(F=15.26)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)(F=11.6)＞浸提時(shí)間(F=7.68)，即料液比對(duì)于嗜酸乳桿菌胞外多糖提取效果的影響力大于酒精濃度而抽提時(shí)間的影響力最小。

表4 各因素的F值大小

2.3.2 交互關(guān)系分析

令其中某一個(gè)因子為0，此時(shí)能夠得到除此因子之外另外2個(gè)因素對(duì)于整個(gè)嗜酸乳桿菌胞外多糖提取效果影響的交互效應(yīng)方程:C=1.092 7+0.324X+0.136Z+0.028X×X+0.189Z×Z－0.367Z×X;C=1.092 7+0.295Y+0.136Z－0.386Y×Y+0.189Z×Z+0.361Z×Y;C=1.092 7+0.324X+0.295Y+0.028X×X－0.386Y×Y+0.03X×Y。通過(guò)sas分析軟件作出各因素之間的兩兩交互關(guān)系。

2.3.3 最佳工藝參數(shù)

對(duì)方程進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化得到其值最大化編碼組合。即:利用最80%的乙醇按1∶1.8的比例提取12 h能夠得到大產(chǎn)量。其胞外多糖產(chǎn)量為1.91 g/L。通過(guò)檢驗(yàn)試驗(yàn)得到產(chǎn)量為1.85 g/L。

2.3.4 胞外多糖的分離純化

所得到的粗多糖經(jīng)DEAE-Cellulose 52和Sephadex G-200分離的結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 粗多糖經(jīng)DE-52和Sephadex G-200分離情況

在DE-52分離柱中，利用0.1 moL/L的NaOH溶液洗脫分別得到2種胞外多糖組分，第1個(gè)組分出現(xiàn)在1.5～2 h(10～15管)和2.3～3h(15～18管)的時(shí)候，最高峰值分別能夠達(dá)到0.8 g/L和0.35 g/L。當(dāng)洗脫超過(guò)3 h之后基本沒(méi)有明顯的多糖成分被洗脫下來(lái)。將分離過(guò)程中含量較高的第1組份(10～15管)集中收集起來(lái)，放入透析帶中4℃透析48h，冷凍干燥留作Sephadex G-200繼續(xù)分離。其結(jié)果見(jiàn)圖4，從圖4可以看出用DE-52收集得到的組分A再繼續(xù)分離后又得到3個(gè)組，其分別出峰時(shí)間為2小時(shí)45分鐘到5小時(shí)，含量接近0.35 mg/mL;第2個(gè)峰出現(xiàn)在5～8 h，其產(chǎn)量達(dá)到0.25 mg/mL;第3個(gè)峰出現(xiàn)在8 h之后，產(chǎn)量很小只有0.05 mg/mL。同時(shí)由核算蛋白測(cè)定儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)第2個(gè)峰中含有明顯的蛋白質(zhì)。由此可以判斷在粗多糖經(jīng)過(guò)DE-52和Sephadex G-200分離之后的第2個(gè)組分是糖蛋白的復(fù)合物。同時(shí)收集Sephadex G-200分離得到含量較多的組分(A組分)冷凍干燥留作備用。

2.3.5 組分A的氣相分析

將鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖的單糖標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行氣相色譜，分析發(fā)現(xiàn)A組分的糖鏈中含有的單糖有:鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖，它們的相對(duì)含量為 3.35∶1∶1∶1。

3 結(jié)論

采用乙醇分級(jí)沉淀的方法，建立起酒精沉淀提取嗜酸乳桿菌胞外多糖的模擬方程:C=1.092 734+0.323 974X+0.294 948Y+0.136 121Z+0.028 276X×X－0.386 224Y×Y+0.189 776Z×Z－0.367 432Z×X+0.361 421Z×Y+0.030 059X×Y。通過(guò)對(duì)該方程的回歸系數(shù)檢驗(yàn)得知在利用酒精提取嗜酸乳桿菌胞外多糖的時(shí)候提取時(shí)間，乙醇體積分?jǐn)?shù)，料液比3個(gè)影響因素的主次關(guān)系是:料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞浸提時(shí)間。

在單因素的基礎(chǔ)之上采用旋轉(zhuǎn)正交的方法對(duì)多糖的提取量進(jìn)行最大化的工藝優(yōu)化，得到在80%(體積分?jǐn)?shù))的酒精按1∶1.8(體積比)的比例提取12 h能夠得到最大產(chǎn)量。其胞外多糖產(chǎn)量為1.85 g/L。

將得到的粗多糖經(jīng)DE-52和Sephadex G-200分離之后得到其中含量最大的組分A，并利用氣相色譜儀對(duì)其進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其糖鏈?zhǔn)怯墒罄钐?、木糖、葡萄糖、半乳糖所組成。其單糖分子含量之比為3.35∶1∶1∶1。同時(shí)氣相分析發(fā)現(xiàn)在嗜酸乳桿菌胞外多糖中有一個(gè)組分是明顯的蛋白糖復(fù)合體。

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The Optimization of Extro-polysaccharides of Lactobacillus acidophilus in Extraction

Liu Qi，Liu Ai-hong，Sun Mei-ling，Li Fu-jie
(Department of bioengineering，Zhi Xing college of HuBei University，Wuhan 430011，China)

Lactobacillus acidophilus，which is recognized as a safe fermentation creature，is probiotics which can stay in human intestinal wall.Many strains have been the stars in the food industry for a long time.The extro-polysacchrides of bacteria are macromolecule polymers which are secreted during the incubation or in the cell wall to protect the bacteria during incubation.The polysacchrides are diluted in the water.Its perfect characteristics in rheology and physics has put it on the stage for research and production.The extro-polysacchrides of lactobacii are not only important for flavor and quality of dairy，but also a secure source of polysaccharides，because of its capability of stabilizing and emulsifying the humidity of diary product.In this article，extraction of the extro-polysacchrides of lactobacillus acidophilus is optimized with the SAS software.The yield of polysaccharides is 1.91 g/L by extraction 80%ethanol(1:1.8)for 12hours.

Lactobacillus acidophilus，extro-polysacchride，extraction optimization

碩士研究生。

2010－02－04，改回日期:2010－07－02