唐 甜 陜 光

Epo／Epo-R在非小細(xì)胞肺癌中的表達和MVD關(guān)系及意義

唐 甜 陜 光1＊

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤Ⅱ科，1武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿Ⅱ科 湖北430060）

目的 探討Epo／Epo-R在非小細(xì)胞肺癌中的表達和腫瘤微血管密度（MVD）關(guān)系及意義。方法 收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2008-2010年非小細(xì)胞肺癌存檔蠟塊40例（男28例，女12例），采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測40例非小細(xì)胞肺癌及癌旁組織中Epo／Epo-R的表達水平，并采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)對Epo／Epo-R的表達進行定量分析，用SPSS11.5軟件對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK（q）檢驗。同時檢測腫瘤微血管密度（MVD），分析與臨床病理之間的關(guān)系。結(jié)果 Epo／Epo-R在非小細(xì)胞肺癌中的表達明顯高于癌旁組織。圖像分析結(jié)果顯示：兩組間差異有顯著性意義（P＜0.05）。Epo／Epo-R表達陽性組織中，MVD計數(shù)顯著高于Epo／Epo-R表達陰性者（P＜0.05）。結(jié)論 Epo／Epo-R在非小細(xì)胞肺癌中呈高表達，并與微血管密度（MVD）密切關(guān)系，聯(lián)合檢測Epo／Epo-R和MVD更有利于正確判斷疾病的臨床病理特征及其預(yù)后。

非小細(xì)胞肺癌；Epo／Epo-R；MVD；免疫組織化學(xué)

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，現(xiàn)已成為人類癌癥死亡的最主要原因之一。肺癌是目前全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，并且仍有上升的趨勢，是對人體健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一［1］。

紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）和紅細(xì)胞生成素受體（erythropoietin recep tor，EPOR）是調(diào)節(jié)紅系祖細(xì)胞增殖、分化和生存所必需的關(guān)鍵細(xì)胞因子。近年來，國內(nèi)外研究進一步發(fā)現(xiàn)，EPOR不僅存在于幼紅細(xì)胞，在其它細(xì)胞也有發(fā)現(xiàn)，如神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞、胰腺、肺、肝臟、腎臟、子宮、實質(zhì)瘤等也有EPOR的表達。近年來大量的研究發(fā)現(xiàn)EPO具有抗炎、抗凋亡、神經(jīng)保護等非促紅細(xì)胞生成作用。但也有人認(rèn)為Epo有可能直接或間接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長而促進疾病進展，而這與 Epo-R 有關(guān)［2］。

本文采用免疫組化和圖像分析方法檢測和分析了肺癌組織中Epo／Epo-R的表達和腫瘤微血管密度（MVD）關(guān)系，為肺癌的診斷和治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

1.材料

病例資料和分組

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院2008-2010年臨床手術(shù)切?。ú±砬衅\斷）的非小細(xì)胞肺癌40例，另取瘤組織周圍正常肺組織5例作對照。其中男28例，女12例，年齡58-76歲，中位年齡60.5歲。組織學(xué)分類：腺癌20例，鱗癌16例，腺鱗癌4例。病理分級：Ⅰ級（高分化）13例，Ⅱ級（中分化）18例，Ⅲ級（低分化）9例。臨床分期（TNM分期）：Ⅰ期13例，Ⅱ期20例，Ⅲ期7例。所有病例術(shù)前均未行放、化療。

2.方法

2.1 HE染色 常規(guī)取材、固定、脫水、透明、包埋、切片、HE染色及封片。

2.2 免疫組織化學(xué)SP法檢測Epo／Epo-R和第Ⅷ因子相關(guān)抗原

具體步驟：5μm組織切片常規(guī)脫蠟至水后，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；抗原修復(fù)（檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法），室溫自然冷卻后，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗5×3min；滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；甩去多余血清，分別滴加一抗，4℃孵育過夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；滴加生物素標(biāo)記的二抗37℃濕盒孵育10min，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育10min，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應(yīng)時間（約3-5min），自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，流水沖洗，0.1%氨水返藍(lán)；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為Epo／Epo-R的陽性對照組。

3.免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

Epo／Epo-R以細(xì)胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，Ⅷ因子相關(guān)抗原以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)（同濟千屏影像公司）對Epo／Epo-R的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積／單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）。MVD測定：以內(nèi)皮細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為微血管密度區(qū)，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400）計數(shù)腫瘤組織中與臨近微血管。結(jié)果以5個視野血管的均數(shù)表示。

4.統(tǒng)計學(xué)處理

對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和Spearman等級相關(guān)分析。

結(jié) 果

1.EPO的表達 非小細(xì)胞肺癌胞膜及胞漿內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒，EPO呈陽性表達（圖1）；癌旁組織細(xì)胞胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，EPO呈陰性表達（圖2）。圖像分析結(jié)果見表1，經(jīng)單因素分析非小細(xì)胞肺癌與癌旁組織比較，差異有顯著性（P＜0.05）。見表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌和癌旁組織中EPO表達的平均光密度和陽性面積率（ˉx±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of EPO in NSCLC and cancer side tissue（ˉx±s）

2.Epo-R的表達 非小細(xì)胞肺癌胞膜及胞漿內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒，Epo-R呈陽性表達（圖3）；癌旁組織細(xì)胞胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，Epo-R呈陰性表達（圖4）。圖像分析結(jié)果見表2，經(jīng)單因素分析非小細(xì)胞肺癌與癌旁組織比較，差異有顯著性（P＜0.05）。見表2。

表2 非小細(xì)胞肺癌和癌旁組織中Epo-R表達的平均光密度和陽性面積率（ˉx±s）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of Epo-R in NSCLC and cancer side tissue（ˉx±s）

3.MVD的檢測 非小細(xì)胞肺癌組MVD為28.60±7.63，癌旁組織 MVD為16.18±6.53。MVD與Epo-R等級相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn) MVD與Epo-R兩者的表達呈正相關(guān)。Spearman等級相關(guān)系數(shù)為0.457（P＜0.01）。

討 論

EPO及其受體EPOR是促進哺乳動物紅系祖細(xì)胞增殖和分化的主要細(xì)胞因子。近年來，隨著對人和動物的EPO分子克隆以及EPOR的突變體分析，對EPO與EPOR的相互作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑有了比較深入的了解。人類EPO基因位于7號染色體長臂22區(qū)，有多肽和糖基構(gòu)成，相對分子質(zhì)量約34×103，含有2個二硫鍵、一個碳末端的精氨酸（Arg）殘基［3］。細(xì)胞內(nèi)無任何形式的EPO貯備，組織缺氧是刺激EPO合成釋放的主要因素，缺氧可直接通過誘導(dǎo)EPO基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控EPO的表達，這一機制最主要的調(diào)節(jié)因子是低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxiainducing factor-1，HIF-1）［4］。以往認(rèn)為，EPOR僅存在于早期紅系細(xì)胞，而近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，在很多非造血組織和細(xì)胞中，如神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞、胰腺、肺、肝臟、腎臟、子宮、實質(zhì)瘤等也有EPOR的表達。近年來大量的研究發(fā)現(xiàn)EPO具有抗炎、抗凋亡、神經(jīng)保護等非促紅細(xì)胞生成作用，而其功能的發(fā)揮依賴EPO／EPOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，亦稱為經(jīng)典理論［5-7］。該理論認(rèn)為EPOR介導(dǎo)的EPO生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮依賴EPO與EPOR結(jié)合后EPO誘導(dǎo)Jak2磷酸化。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測了Epo／Epo-R在非小細(xì)胞肺癌中的表達，結(jié)果：Epo／Epo-R在非小細(xì)胞肺癌中的表達明顯高于癌旁組織。圖像分析結(jié)果顯示：兩組間差異有顯著性意義（P＜0.05）。提示：在非小細(xì)胞肺癌組織中表達EPO和EPOR可能是一種較為普遍的現(xiàn)象，二者在腫瘤組織中高表達提示EPO-EPOR信號途徑可能參與了腫瘤的惡性生物學(xué)行為；而EPO、EPOR在非小細(xì)胞肺癌組織中過表達，提示EPO、EPOR在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起重要作用。關(guān)于EPO在腫瘤組織高表達的機制目前認(rèn)為與缺氧有關(guān)。惡性腫瘤組織生長代謝旺盛，導(dǎo)致部缺氧和壞死是實體腫瘤內(nèi)部的一種常見特征［8-10］，缺氧條件導(dǎo)致 HIF-1的水平升高，HIF-1的過表達誘導(dǎo)許多與腫瘤缺氧有關(guān)的基因的表達［11］，EPO是其效應(yīng)分子之一，因而表達升高。腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移能力與腫瘤的促血管形成密切相關(guān)［12］。研究表明［13］，腫瘤直徑達1-2mm 后，要繼續(xù)發(fā)展，必須有足夠的營養(yǎng)供應(yīng)，這樣便需要形成供應(yīng)腫瘤生成的新生血管。腫瘤血管的新生，一方面為腫瘤生長提供營養(yǎng)，另方面增加了血管的通透性，有利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［14］。本實驗還觀察到：在非小細(xì)胞肺癌中Epo／Epo-R表達陽性者，MVD計數(shù)顯著高于癌旁組織Epo／Epo-R表達陰性者（P＜0.05）。非小細(xì)胞肺癌中高表達 Epo／Epo-R，與MVD呈正相關(guān)關(guān)系。提示：Epo／Epo-R在非小細(xì)胞肺癌中的促進新生血管形成的作用。腫瘤微血管數(shù)量愈多，腫瘤細(xì)胞進入血液循環(huán)的機會愈大。持續(xù)無規(guī)則的新生血管的形成促進了腫瘤的生長、侵襲與轉(zhuǎn)移?？梢奅PO-R在人類腫瘤細(xì)胞中表達具有重要作用，可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)育，引起惡性腫瘤新生血管的生長。而新生血管管壁薄弱，發(fā)育欠佳，可能是惡性腫瘤細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移的原因之一。同時實驗中對Epo／Epo-R與 MVD的關(guān)系研究分析發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)（P＜0.01），而Epo／Epo-R陽性表達患者的MVD明顯高于Epo-R陰性表達患者的 MVD，更支持Epo／Epo-R表達與 MVD是相關(guān)的，說明Epo／Epo-R與腫瘤微血管的生成有密切的關(guān)系。因此，如果聯(lián)合檢測Epo-R和MVD多項指標(biāo)，可以更好地分析判斷患者的臨床病理特征。MVD是衡量血管生長的定量指標(biāo)。也可提供一條治療惡性腫瘤的新思路，即針對抗腫瘤血管形成及促進因子的作用，抑制非小細(xì)胞肺癌組織中的血管形成，為惡性腫瘤靶向治療提供新途徑。

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圖 版 說 明

圖1 EPO的表達 非小細(xì)胞肺癌：胞膜及胞漿內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒，EPO呈陽性表達（?）.HE×200

圖2 EPO的表達癌旁組織：癌旁組織細(xì)胞胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，EPO呈陰性表達（?）.HE×200

圖3 Epo-R的表達 非小細(xì)胞肺癌：胞膜及胞漿內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒，Epo-R呈陽性表達（?）.HE×200

圖4 Epo-R的表達 癌旁組織：癌旁組織細(xì)胞胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，Epo-R呈陰性表達（?）.HE×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The expression of EPO NSCLC group：There were plenty of brown particles in the membrane or cytoplasm，which showed EPO expressed positive.S-P×200

Fig.2 The expression of EPO cancer side tissue.There were few brown particles in the membrane or cytoplasm，which showed EPO expressed negative.S-P×200

Fig.3 The expression of EPO-R NSCLC group：There were plenty of brown particles in the membrane or cyto-plasm，which showed EPO-R expressed positive.S-P×200

Fig.4 The expression of EPO-R cancer side tissue.There were few brown particles in the the membrane or cytoplasm，which showed EPO-R expressed negative.S-P×200

Expression and signifrcance of erythropoietin／erythropoietin receptor（Epo／Epo-R）in non-small cell lung cancer（NSCLC）and the relation with microvessel density（MVD）

Tang Tian，Shan Guang1＊
（1Department of Oncology，Renmin Hospital of Wuhan University；2Department of Urology，Renmin Hospital of Wuhan university，Hubei 430060，China）

ObjectiveTo explore the expression of Epo／Epo-R in non-small cell lung cancer（NSCLC）and relation with microvessel density（MVD）.MethodsSpecimens from 40cases（28males and 12females，from 2008to 2010）of non-small cell lung cancer from Pathology Department in Renmin Hospital of Wuhan University were collected.The expression levels of Epo／Epo-R were detected by immunohistochemical S-P staining in the 40specimens of non-small cell lung cancer and adjacent tissues.Average optical density and positive area expression rates of Epo／Epo-R were measured by image analysis（HPIAS-1000）.Statistical evaluations for average optic density and positive area rate of immunohistochemical reaction were performed by using one-way ANOVA and q-test.All data were processed by SPSS11.5.We also detected the microvessel density（MVD）and analysis the relationship with clinical pathology.ResultsThe expression of Epo／Epo-R in NSCLC was significantly higher than that in normal adjacent tissue，and image analysis showed significant differences between the expression of Epo／Epo-R in non-small cell lung cancer and that in adjacent tissues（P＜0.05）.The MVD in Epo／Epo-R positive patients was significantly hight than that in Epo／Epo-R negative patients（P＜0.05）.ConclusionEpo／Epo-R in non-small cell lung cancer is highly expressed and positively correlated with MVD，so the joint detection of Epo／Epo-R and MVD is more conducive to correctly judge the clinical and pathological features of disease and prognosis.

Non-small cell lung cancer；Epo／Epo-R；MVD；Immohistochemistry

R734.2

A

10.3870／zgzzhx.2011.05.012

2011-04-10

2011-08-01

唐甜，女（1981年）漢族，博士，主治醫(yī)師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）