陜 光 唐 甜

抑癌基因DPC4和TGF-β1在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)和意義

陜 光 唐 甜1＊

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿Ⅱ科；1武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤Ⅱ科 湖北430060）

目的 探討膀胱尿路上皮癌中TGF-β1和DPC4的表達(dá)及其意義。方法 收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2000-2006年有完整臨床和病理資料的膀胱尿路上皮癌存檔蠟塊50例和5例癌旁組織，采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測50例膀胱尿路上皮癌和5例癌旁組織中DPC4和TGF-β1的表達(dá)水平。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)，對DPC4和TGF-β1的表達(dá)進(jìn)行定量分析，并用SPSS13.0軟件對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK（q）檢驗(yàn)。結(jié)果 （1）TGF-β1在膀胱尿路上皮癌中呈高表達(dá)，癌旁組織中呈低表達(dá)。膀胱尿路上皮癌與癌旁組織相比，差異有顯著性 （P＜0.05）；（2）DPC4在膀胱尿路上皮癌中呈低表達(dá)，癌旁組織中呈高表達(dá)。膀胱尿路上皮癌與癌旁組織相比，差異有顯著性 （P＜0.05）。結(jié)論 TGF-β1高表達(dá)和DPC4低表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。在膀胱尿路上皮癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

膀胱尿路上皮癌；DPC4；TGF-β1；免疫組織化學(xué)

膀胱癌在男性惡性腫瘤中位居第4位，女性惡性腫瘤中位居第8位［1］。膀胱癌發(fā)病率及死亡率近年來均呈現(xiàn)上升趨勢，可能與吸煙、職業(yè)、大氣污染及飲食結(jié)構(gòu)的改變等有關(guān)，但確切病因還有待進(jìn)一步探索。

轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factorβ，TGF-β）超家族成員是在發(fā)育和組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起中樞作用的多功能生長因子［2］，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、死亡或凋亡、細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成等不同的生物學(xué)功能。TGF-β被認(rèn)為是病理狀態(tài)下細(xì)胞外基質(zhì)積聚導(dǎo)致組織纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［3］。

TGF-β最顯著的生物學(xué)效應(yīng)是對上皮細(xì)胞的生長抑制，此外還包括對分化與凋亡的誘導(dǎo)及對遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的維持。當(dāng)腫瘤細(xì)胞喪失對TGF-β生長抑制的敏感性，過多產(chǎn)生的TGF-β可能作用于腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生侵潤和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)血管的生成，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)［4］。DPC4基因在TGF-β信號通路中編碼一個關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)信使，可以假設(shè)：DPC4基因的缺失在腫瘤的發(fā)展中解除了TGF-β信號途徑的生長抑制效應(yīng)。

DPC4基因的主要功能是作為序列保守的SMADs蛋白家族中的一員，參與轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β超家族在細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)，在TGF-β超家族的信號傳導(dǎo)途徑中處于中樞地位。研究表明，DPC4以缺失與失活和某些腫瘤的發(fā)生與發(fā)展具有密切的聯(lián)系［5］。

我們通過免疫組織化學(xué)方法試圖探討二者與膀胱移行細(xì)胞癌的關(guān)系，以期能進(jìn)一步闡明膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)理，尋找早期預(yù)測膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)標(biāo)記物，為膀胱癌的發(fā)生和復(fù)發(fā)的預(yù)測提供一定的參考依據(jù)。

材料和方法

1.材料

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2004-2006年膀胱尿路上皮癌存檔蠟塊50例（均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為膀胱尿路上皮癌），其中男性38例，女性12例，平均年齡50.3歲，另5例癌旁組織距瘤緣3-5cm。標(biāo)本均經(jīng)HE染色，光鏡觀察診斷，按WHO尿路腫瘤組織學(xué)分類（2004），浸潤性尿路上皮癌30例，非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌；高級別15例，低級別5例；按UICC臨床分期，T1 31 例，T2 11 例，T3-4 8例。其中未經(jīng)化療的初發(fā)腫瘤28例，化療后復(fù)發(fā)腫瘤22例。

2.方法

HE染色 常規(guī)取材、固定、脫水、透明、包埋、切片、HE染色及封片

3.主要試劑

3.1 即用型兔抗人TGF-β1多克隆抗體；（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；

3.2 即用型兔抗人DPC4多克隆抗體；（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；

3.3 超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒；（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；

3.4 DAB顯色試盒及多聚賴氨酸（北京中杉生物技術(shù)有限公司）

4免疫組織化學(xué)SP法檢測TGF-β1和DPC4相關(guān)抗原

具體步驟：5μm組織切片常規(guī)脫蠟至水后，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；抗原修復(fù)，室溫自然冷卻后，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗5×3 min；滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；甩去多余血清，分別滴加一抗，4℃孵育過夜，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗3×5min；滴加生物素標(biāo)記的二抗37℃濕盒孵育10min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育10min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應(yīng)時間（約3-5min），自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，流水沖洗，0.1%氨水返藍(lán)；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為TGF-β1和DPC4的陽性對照組。

5.免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

5.1 TGF-β1和DPC4以細(xì)胞核或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

5.2 采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對TGF-β1和DPC4的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積／單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

結(jié) 果

1.TGF-β1的表達(dá)

膀胱尿路上皮癌細(xì)胞內(nèi)可見較多棕黃色顆粒，TGF-β1呈陽性表達(dá)（圖1）；癌旁組織胞核內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，TGF-β1表達(dá)弱，呈陰性表達(dá)（圖2）。圖像分析結(jié)果見表1。經(jīng)q檢驗(yàn)，膀胱尿路上皮癌與癌旁組織之間，TGF-β1的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05），（表1）。

2.DPC4的表達(dá)

膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中可見少量的棕黃色顆粒，DPC4表達(dá)弱（圖3）；癌旁組織中可見密集分布的棕黃色顆粒，DPC4呈陽性表達(dá)（圖4）。圖像分析結(jié)果見表2。經(jīng)q檢驗(yàn)，膀胱尿路上皮癌與癌旁組織之間，DPC4的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05）（表2）。

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織TGF-β1表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（ˉx±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of TGF-β1in SBladder Urothelial Cancer and cancer side tissue（ˉx±s）

表2 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織DPC4表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（ˉx±s）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of DPC4in bladder urothelial cancer and cancer side tissue（ˉx±s）

討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，目前發(fā)病率呈上升趨勢，且復(fù)發(fā)率高，易產(chǎn)生獲得性耐藥。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，初發(fā)時80%為淺表性，其中70%術(shù)后復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)者30%向高級高期發(fā)展，15%-30%的患者初發(fā)時即具有侵襲性，即使經(jīng)過治療，也較早轉(zhuǎn)移［6］。因此，研究與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)理，尋找早期預(yù)測膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)標(biāo)記物，為膀胱癌的發(fā)生和復(fù)發(fā)的預(yù)測提供一定的參考依據(jù)具有重要的臨床意義。

轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是一簇屬結(jié)構(gòu)相關(guān)的異二聚體多肽，他能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、形態(tài)形成、凋亡等病理過程及刺激細(xì)胞外基質(zhì)分泌，抑制免疫反應(yīng)等［7-9］，TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常與腫瘤關(guān)系密切 .該通路的異常常見于一些來源于上皮細(xì)胞腫瘤發(fā)展的晚期，并且常與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān).其中TGF-β1是這一家族的主要成員 .TGF-β信號可抑制B細(xì)胞Ig的合成，TGF-β1在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)能夠破壞宿主T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，并引起CTL（cytolyic T cell）反應(yīng)，縱容了腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展［10-12］。

目前認(rèn)為，TGF-β1在腫瘤的發(fā)展中扮演了雙重角色，早期當(dāng)細(xì)胞對TGF-β1的抗增殖效應(yīng)仍有反應(yīng)時，TGF-β1起著腫瘤抑制作用；而在惡性演進(jìn)期，當(dāng)細(xì)胞獲得了對TGF-β1生長抑制作用的耐受性時，腫瘤細(xì)胞可自分泌大量的TGF-β1，通過改變腫瘤組織的微環(huán)境，如誘導(dǎo)腫瘤血管生成，提高腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力，免疫抑制及胞外基質(zhì)的合成等來促進(jìn)腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移［13-15］。

TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是機(jī)體內(nèi)抑制細(xì)胞生長、增殖和分化的有效途徑，但在許多研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對TGF-β失去反應(yīng)而逃避TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的生長抑制作用，這種反應(yīng)的丟失不僅與TβR-Ⅱ，Smad 2等信號分子的失活有關(guān)，而且與DPC4的變異密切相關(guān)［16-17］。

抑癌基因DPC4是一種腫瘤抑制基因。其所編碼的Smad4蛋白是轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β1信號的重要胞質(zhì)內(nèi)信號級聯(lián)分子，調(diào)節(jié) TGF-β1應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄.Smad4功能失活或表達(dá)低下影響TGF-β1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并參與腫瘤的形成［12］。相關(guān)報(bào)道研究發(fā)現(xiàn)Smad4在多種腫瘤如膽囊癌、口腔鱗癌、膀胱癌等表達(dá)下調(diào)，并可調(diào)控T G F-β細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞生長［18-20］。

我們采用免疫組織化學(xué)的方法，對膀胱尿路上皮癌組織中TGF-β1和DPC4的表達(dá)進(jìn)行檢測，旨在探討他們與膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。結(jié)果表明：TGF-β1在膀胱尿路上皮癌中呈高表達(dá)，癌旁組織中呈低表達(dá)。而DPC4在膀胱尿路上皮癌中呈低表達(dá)，癌旁組織中呈高表達(dá)。提示：DPC4基因的缺失或突變阻斷了TGF-β1抑制腫瘤生長的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而這種阻斷作用又可能通過負(fù)反饋?zhàn)饔檬鼓[瘤細(xì)胞自分泌TGF-β1增加，二者可能共同調(diào)節(jié)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及生物學(xué)行為。

TGF-β1和DPC4是TGF-β轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要作用的關(guān)鍵因子，TGF-β1高表達(dá)和DPC4低表達(dá)可作為膀胱尿路上皮癌預(yù)后不良的指標(biāo)。同時DPC4在TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有關(guān)鍵作用，其缺失或突變可使細(xì)胞對TGF-β1的生長抑制產(chǎn)生耐受，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

DPC4在膀胱尿路上皮癌中的低表達(dá)也說明TGF-β1抑制腫瘤生長的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被阻斷，這種阻斷作用在轉(zhuǎn)錄過程中以及顯現(xiàn)。這種阻斷作用可能同時還是TGF-β1在腫瘤中高表達(dá)的原因。由于膀胱尿路上皮癌組織細(xì)胞失去了對TGF-β1的敏感性，導(dǎo)致TGF-β1的反饋性表達(dá)升高，而升高的TGF-β1表達(dá)失去抑制腫瘤生長的作用，卻沒有喪失對NK，LAK等免疫細(xì)胞的抑制作用，因此TGF-β1高表達(dá)和DPC4低表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。其確切機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

［1］Yakasai A，Allam M，Thompson AJ，et al.Incidence of bladder cancer in a one-stop clinic.Ann Afr Med.2011，10（2）：112-114

［2］Cheng J，Grande J P.Transforming growth factor-beta signal transduction and progressive renal disease.Exp Biol Med（Maywood），2002，227（11）：943-956

［3］Choi ME.Mechanism of transforming growth factor-betal signaling.Kidney Int，Supp1.2000，77：S53-58

［4］Langenskiold M，Holmdahl L，F(xiàn)alk P，et al.Increased TGF-beta 1protein expression in patients with advanced colorectal cancer.J Surg Oncol 2008，97：409-415

［5］Schwarte-Waldhoff I，Volpert OV，Bouck NP，et al.Smad4／DPC4-mediated tumor suppression through suppression of angiogenesis.Proc Natl Acad Sci U S A 2000，97：9624-9629

［6］Vlahou A.Back to the future in bladder cancer research.Expert Rev Proteomics.2011Jun，8（3）：295-297

［7］Zhu Y，Shen J，Hu YY，et al.Transforming growth factor-β1regulates renalα3andβ1integrin expressions in diabetic rats：a new insight into the renoprotective effect of irbesartan.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao.2011，20；31（6）：1059-1062

［8］Wang J，Chen J，Zhang K，et al.TGF-β1regulates the invasive and metastatic potential of mucoepidermoid carcinoma cells.J Oral Pathol Med.2011，21.doi：10.1111／j.1600-0714.

［9］Toffoli B，Pickering RJ，Tsorotes D，et al.Osteoprotegerin promotes vascular fibrosis via a TGF-β1autocrine loop.Atherosclerosis.2011，May 27

［10］Shi M，Zhu J，Wang R，Chen X，et al.Latent TGF-β structure and activation.Nature.2011，474（7351）：343-349

［11］Walshe TE，Leach LL，D＇Amore PA，et al.TGF-βsignaling is required for maintenance of retinal ganglion cell differentiation and survival.Neuroscience.2011，May 27

［12］Hartmann MC，Dwyer RM，Costello M，et al.Relationship between CCL5and transforming growth factorβ1（TGFβ1）in breast cancer.Eur J Cancer.2011，Jun 7

［13］Ritz MF，Graumann U，Gutierrez B，et al.Traumatic spinal cord injury alters angiogenic factors and TGF-beta1that may affect vascular recovery.Curr Neurovasc Res.2010，7（4）：301-310

［14］Abarbanell AM，Coffey AC，F(xiàn)ehrenbacher JW，et al.Proinflammatory cytokine effects on mesenchymal stem cell therapy for the ischemic heart.Ann Thorac Surg.2009，88（3）：1036-1043

［15］Kim HJ，Park JB，Won HY，Chang H，et al.Serum Levels of TGF-beta1，TIMP-1and TIMP-2in Patients with Lumbar Spinal Stenosis and Disc Herniation.Asian Spine J.2007，1（1）：8-11

［16］Ghosh J，Murphy MO，Turner N，et al.The role of transforming growth factor beta1in the vascular system.Cardiovasc Pathol.2005，14（1）：28-36

［17］B?ttner M，Krieglstein K，Unsicker K，et al.The transforming growth factor-betas：structure，signaling，and roles in nervous system development and functions.J Neurochem.2000，75（6）：2227-2240

［18］Liffers ST，Maghnouj A，Munding JB，et al.Keratin 23，a novel DPC4／Smad4target gene which binds 14-3-3ε.BMC Cancer.2011，14；11：137

［19］Hao J，Zhang S，Zhou Y，et al.MicroRNA 421suppresses DPC4／Smad4in pancreatic cancer.Biochem Biophys Res Commun.2011，25；406（4）：552-557

［20］Nikolic A，Kojic S，Knezevic S，et al.Structural and functional analysis of SMAD4gene promoter in malignant pancreatic and colorectal tissues：Detection of two novel polymorphic nucleotide repeats.Cancer Epidemiol.2011，35（3）：265-271

圖 版 說 明

圖1 TGF-β1的表達(dá)：膀胱尿路上皮癌組 細(xì)胞核和胞漿內(nèi)可見較多棕黃色顆粒，TGF-β1呈陽性表達(dá)（?）。SP×200

圖2 TGF-β1的表達(dá)：癌旁組織 細(xì)胞核和胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，TGF-β1呈陰性表達(dá)（?）。SP×200

圖3 DPC4的表達(dá)：膀胱尿路上皮癌組 細(xì)胞核和胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，DPC4呈陰性表達(dá)（?）。SP×200

圖4 DPC4的表達(dá)：癌旁組織 細(xì)胞核和胞漿內(nèi)可見較多棕黃色顆粒，DPC4呈陽性表達(dá)（?）。SP×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The expression of TGF-β1bladder urothelial cancer group：There were plenty of brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed TGF-β1expressed positive.S-P×200

Fig.2 The expression of TGF-β1：cancer side tissue.There were few brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed TGF-β1expressed negative.S-P×200

Fig.3 The expression of DPC4：bladder urothelial cancer group：There were few brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed DPC4expressed negative.S-P×200

Fig.4 The expression of DPC4：cancer side tissue：There were plenty of brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed DPC4expressed positive.S-P×200

Expression and significance of DPC4and TGF-β1in Bladder Urothelial Cancer

Shan Guang，Tang Tian1＊
（Department of Urology，Renmin Hospital of Wuhan University；1Department of Oncology，Renmin Hospital of Wuhan University，Hubei 430060，China）

ObjectiveTo investigate the expression and significance of DPC4and TGF-β1in bladder urothelial cancer tissues.MethodsFifly cases of bladder urothelial cancer，parafflin-embeded specimen and 5cases of normal tissues near the bladder urothelial cancer，which were all filed in full pathological and clinical data，were collected from the pathology department of the People Hospital of Wuhan University between 2000and 2006.The expression of DPC4and TGF-β1were detected by immunohistochemical S-P method.Quantitative analysis of the DPC4and TGF-β1were measured by high definition pathological graphics context report system （HPIAS-1000）.One-way analysis of variance and SNK（q）tests were used to analyse the mean density and the positive area rate of the immunohistochemical results.All data are processed by SPSS13.0.Results（1）The expression of TGF-β1in bladder urothelial cancer was significantly higher than that in cancer side tissue（P＜0.05）.（2）The expression of DPC4in cancer side tissue was significantly higher than that in bladder urothelial cancer（P＜0.05）.ConclusionThe high expression of TGF-β1and the low expression of DPC4may promote the immuneescape of tumor cells.and the high expression of TGF-β1and the low expression of DPC4played an important role in bladder urothelial cancer development.

Bladder Urothelial Cancer；TGF-β1；DPC4；Immunohistochemistry

R735.2

A

10.3870／zgzzhx.2011.05.014

2011-06-10

2011-08-01

陜光，男（1980年），漢族，博士，主治醫(yī)師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）