夏 欣 李鑫磊 楊樹才 孔 建 馬 晶＊

VEGF-C和CCR7的表達與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系

夏 欣1，2李鑫磊1楊樹才1孔 建1馬 晶1＊

（1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)解剖教研室，黑龍江150081；2黑龍江省醫(yī)院，哈爾濱150036）

目的 觀察血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）-C和趨化因子受體CCR7在卵巢癌組織內(nèi)的表達情況，分析VEGF-C和CCR7的表達與癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。方法 取卵巢癌病例72例，其中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組46例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組26例。應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察VEGF-C和CCR7在卵巢癌組織內(nèi)的表達。結(jié)果 VEGF-C和CCR7主要表達于卵巢癌細胞胞漿或／和胞膜內(nèi)，VEGF-C和CCR7在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達率分別是71.7%和78.2%，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達率分別是30.8%和26.9%，二者在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達率均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.01）。VEGF-C和CCR7蛋白同時陽性表達在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達率分別為65.2%和15.4%，VEGF-C和CCR7的表達具有顯著的相關(guān)性（P＜0.01），聯(lián)合檢測VEGF-C和CCR7診斷卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有較高的準(zhǔn)確度，ROC曲線下面積達0.791。結(jié)論 VEGF-C和CCR7表達在卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，VEGF-C和CCR7在促進卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能具有一定的協(xié)同作用，二者聯(lián)合檢測有助于預(yù)示卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷。

VEGF-C；CCR7；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；卵巢癌

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）-C是在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起重要作用的分子，其蛋白的表達與淋巴管生成數(shù)量呈正比，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)［1］。VEGF-C作為調(diào)控淋巴管發(fā)育及淋巴管生成的特異因子及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性在動物實驗及臨床病理實驗中已經(jīng)得到證實［2］。CCR7是CC類趨化因子受體，近年來，研究者在多種腫瘤中檢測到CCR7的表達，并發(fā)現(xiàn)CCR7的表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3，4］。但 VEGF-C和 CCR7在卵巢癌組織中的表達有沒有相關(guān)性還需進一步研究。為此，本實驗采用免疫組化法分別檢測72例卵巢癌組織中VEGF-C和CCR7蛋白的表達及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并進一步探討VEGF-C和CCR7聯(lián)合檢測在預(yù)示卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險中的價值。

材料和方法

1.材料

所有標(biāo)本取自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院確診為卵巢上皮癌患者的存檔蠟塊72例，臨床病理資料完整，其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例。兔抗人VEGF-C和CCR7多克隆抗體購自Santa Cruz公司。PV-6001免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2.免疫組化染色

取4μm厚的組織切片，常規(guī)脫蠟至水，0.3%H2O2孵育30min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。0.01MPBS沖洗5min×3次，高壓抗原修復(fù)：將切片浸入0.01M 檸檬酸鹽抗原修復(fù)液（pH＝6.0），高壓2min，自然冷卻至室溫。0.01MPBS沖洗5min×3次，滴加一抗（VEGF-C的工作濃度為1：100；CCR7的工作濃度為1：200），4℃孵育過夜。0.01MPBS沖洗5min×3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min。0.01MPBS沖洗5min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光鏡觀察。PBS代替一抗作為陰性對照。

3.圖像分析和統(tǒng)計學(xué)處理

VEGF-C和CCR7的表達以細胞膜或胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，以10個高倍視野中至少有10%的腫瘤細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者判斷為VEGF-C和CCR7表達陽性。VEGF-C和CCR7的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析，P＜0.05表示差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.VEGF-C在卵巢癌組織中的表達

VEGF-C蛋白主要表達于卵巢癌組織原發(fā)灶癌細胞的胞漿內(nèi)，為棕黃色細顆粒（圖1），卵巢癌組織中 VEGF-C 表達的陽性率為56.8%（41／72）。其中，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的46例卵巢癌樣本中，VEGF-C的陽性率為71.7%（33／46），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的26例樣本中，VEGF-C的陽性率30.8%（8／26），二者之間差異具有顯著性（P＜0.01），表明 VEGF-C的表達與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

2.CCR7在卵巢癌組織中的表達

CCR7蛋白主要表達于卵巢癌組織癌細胞的胞漿或／和胞膜上，呈棕黃色顆粒（圖2）。72例卵巢癌組織中CCR7蛋白表達的陽性率為59.7%（43／72），其中，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的46例卵巢癌組織中，CCR7的陽性率為78.2%（36／46），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的26例樣本中，CCR7的陽性率為26.9%（7／26），CCR7在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達率明顯高于在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達率（P＜0.01）。

3.卵巢癌組織中VEGF-C和CCR7表達之間的關(guān)系

VEGF-C和CCR7蛋白同時表達在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中陽性率分別為65.2%和15.4%，二者的表達具有顯著的相關(guān)性（P＜0.01），見表1。tochemistry×200

表1 卵巢癌組織內(nèi)VEGF-C和CCR7的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系Table 1 Relationship betweenVEGF-C and CCR7expression and lymph node metastasis in epithelial ovarian carcinoma

圖1 卵巢癌組織內(nèi)VEGF-C的表達 免疫組化法×400A：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組卵巢癌組織內(nèi)VEGF-C的表達 B：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組卵巢癌組織內(nèi)VEGF-C的表達Fig.1 Expression of VEGF-C in ovarian carcinoma with lymph node metastasis group（A）and nonmetastasis group（B）.Immunohistochemistry×400

圖2 卵巢癌組織內(nèi)CCR7的表達 免疫組化法×200A：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組卵巢癌組織內(nèi)CCR7的表達 B：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組卵巢癌組織內(nèi)CCR7的表達Fig.2 Expression of CCR7in ovarian carcinoma with lymph node metastasis（A）and nonmetastasis group（B）.Immunohis-

4.VEGF-C和CCR7蛋白共同檢測在預(yù)測卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用

在本回顧性研究中，VEGF-C與CCR7在診斷卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值（PPV）和 陰 性 預(yù) 測 值 （NPV）分 別 為 71.7%、30.8%、80.5%、41.9%和78.2%、26.9%、83.7%、34.5%。我們對結(jié)果進行ROC分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測VEGF-C和CCR7在預(yù)測卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確度較高，ROC曲線下面積（AUC）達0.791（圖3）。

討 論

血道轉(zhuǎn)移和淋巴道轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的兩種主要方式。Stacker和Skobe［5，6］第一次用直接的實驗數(shù)據(jù)證實，腫瘤細胞可以通過表達淋巴管生成的調(diào)控因子VEGF-C來誘導(dǎo)淋巴管新生，從而促進腫瘤細胞的淋巴道轉(zhuǎn)移。此后，很多針對不同腫瘤的研究都陸續(xù)得出了相似的結(jié)論。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一系列復(fù)雜的過程，在此過程中需要多種分子和細胞參與反應(yīng)［7］，其中包括血管和（或）淋巴管的誘導(dǎo)生成，腫瘤細胞脫落并進入血管或淋巴管，被靶組織微脈管隨機或特異性捕獲，離開脈管并向組織器官浸潤，直至形成轉(zhuǎn)移灶［8］。

圖3 聯(lián)合檢測VEGF-C和CCR7預(yù)測卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Fig.3 Combined examination of VEGF-C and CCR7for judging lymph node metastasis in ovarian carcinoma.

趨化因子C、CC、CXC和CX3C四個家族中CC和CXC家族占了已發(fā)現(xiàn)的趨化因子的大多數(shù)。趨化因子受體為G蛋白耦聯(lián)受體，它們均具有7個跨膜區(qū)域。目前為止約發(fā)現(xiàn)了50種趨化因子和至少19種趨化因子受體近年的研究表明：趨化因子及其受體可能在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟中發(fā)揮關(guān)鍵的作用［9］。

有研究表明［10］，淋巴管內(nèi)皮細胞通過分泌趨化因子吸引腫瘤細胞，進而主動引導(dǎo)腫瘤細胞淋巴轉(zhuǎn)移，這一過程類似于免疫刺激過程中樹突狀細胞的定向遷移。在腫瘤細胞定向遷移過程中，趨化因子通過與腫瘤細胞表面相應(yīng)受體的作用誘導(dǎo)腫瘤細胞骨架重排，促使腫瘤細胞緊密粘附于淋巴管內(nèi)皮細胞，最終實現(xiàn)定向性遷移。由此推測CCR7的活化可能在腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。

Müller等［11］在乳腺癌組織中檢測到CCR7的高表達，他們發(fā)現(xiàn)與淋巴細胞一樣，一定濃度的CCR7的配體能夠明顯增加乳腺癌細胞內(nèi)肌動蛋白的含量和聚合，在腫瘤細胞中高水平的肌動蛋白聚合是細胞形成偽足的必需條件，而偽足的形成是惡性腫瘤細胞侵襲組織和遠處遷移的早期事件［12］，這進一步證實了CCR7在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的重要作用。隨后研究者在胃癌、食管癌、結(jié)腸癌及甲狀腺癌等多種腫瘤中檢測到CCR7的表達，而且其表達和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［13］。

本研究結(jié)果顯示，VEGF-C和CCR7蛋白在卵巢癌組織中均有較高的表達，分別達56.8%和59.7%。CCR7陽性卵巢癌組織中VEGF-C蛋白陽性率明顯高于CCR7陰性者中的VEGF-C蛋白陽性率，兩者表達呈正相關(guān)。從目前的研究推斷，VEGF-C在淋巴管生成和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用較明確，而且其起作用也較直接，可能是CCR7的活化促進了VEGF-C的表達，從而介導(dǎo)了卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過程［14］。當(dāng)然，這還需要對CCR7因子的作用做進一步的研究才能確定。聯(lián)合檢測參與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多個因子將更有助于精確預(yù)測卵巢癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究顯示，當(dāng)聯(lián)合檢測VEGF-C和CCR7時，ROC曲線下面積達0.791，具有較高的診斷價值。綜上所述，本研究表明VEGF-C和CCR7的表達與卵巢癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過對活檢標(biāo)本進行VEGF-C和CCR7聯(lián)合檢測將有助于卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險的早期預(yù)測。

［1］Tammela T，Petrova TV，Alitalo K.Molecular lym-phangiogenesis：new players.Trends Cell Biol，2005，15（8）：434-441

［2］Deguchi K，Ichikawa D，Soga K，et al.Clinical significance of vascular endothelial growth factors C and D and chemokine receptor CCR7in gastric cancer.Anticancer Res，2010，30（6）：2361-2366

［3］Kodama J，Hasengaowa，Kusumoto T，et al.Association of CXCR4and CCR7chemokine receptor expression and lymph node metastasis in human cervical cancer.Ann Oncol，2007，18（1）：70-76

［4］Tsuzuki H，Takahashi N，Kojima A，et al.Oral and oropharyngeal squamous cell carcinomas expressing CCR7have poor prognoses.Auris Nasus Larynx，2006，33（1）：37-42

［5］Stacker SA，Caesar C，Baldwin ME，et al.VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics.Nat Med，2001，7（2）：186-191

［6］Skobe M，Hawighorst T，Jackson DG，et al.Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.Nat Med，2001，7（2）：192-198

［7］馬勇，陳明偉，劉冰華，等 .VEGF-D的表達與膀胱移行細胞癌LVD及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 .中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2010，19（1）：81-84

［8］Nathanson SD.Insights into the mechanisms of lymph node metastasis.Cancer，2003，98（2）：413-423

［9］Schimanski CC，Bahre R，Gockel I，et al.Chemokine receptor CCR7enhances intrahepatic and lymphatic dissemination of human hepatocellular cancer.Oncol Rep，2006，16（1）：109-113

［10］Murphy PM.Chemokines and the molecular basis of cancer metastasis.N Engl J Med，2001，345（11）：833-835

［11］Müller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis.Nature，2001，410（6824）：50-56

［12］Wiley HE，Gonzalez EB，Maki W，et al.Expression of CC chemokine receptor-7and regional lymph node metastasis of B16murine melanoma.J Natl Cancer Inst，2001，93（21）：1638-1643

［13］Sancho M，Vieira JM，Casalou C，et al.Expression and function of the chemokine receptor CCR7in thyroid carcinomas.J Endocrinol，2006，191（1）：229-238

［14］Brand S，Dambacher J，Beigel F，et al.CXCR4and CXCL12are inversely expressed in colorectal cancer cells and modulate cancer cell migration，invasion and MMP-9activation.Exp Cell Res，2005，310（1）：117-130

The expression of VEGF-C and CCR7and their correlationship 7with lymph node metastasis in ovarian carcinoma

Xia Xin1，2，Li Xinlei1，Yang Shucai1，Kong Jian1，Ma Jing1＊
（1Department of Anatomy，Harbin Medical University，Heilongjiang150081，
2Heilongjiang Provincial Hospital，Harbin150036，China）

ObjectiveTo investigate the effects of vascular endothelial growth factor（VEGF）-C and CCR7on tumor lymph node metastasis，we observed the expression of VEGF-C and CCR7in epithelial ovarian carcinoma.MethodsSeventy-two paraffin-embedded stored specimens from patients with ovarian carcinoma were included in this study.They were devided into the lymph node metastasis group（n＝46）and the nonmetastasis group（n＝26）.The expressions of VEGF-C and CCR7were detected by immunohistochemical staining.ResultsVEGF-C and CCR7proteins were observed predominantly in the cytoplasm or／and on membrane of the tumor cells.The positive rate of VEGF-C and CCR7expression in the lymph node metastasis group was 71.7%and 78.2%respectively，but 30.8%and 26.9%in the nonmetastasis group，with significant diferences（P＜0.01）.The synergic expression rate of VEGF-C and CCR7was 65.2%and 15.4%in the lymph node metastasis group and the nonmetastasis group respectively，with statistical significance（P＜0.01）.High accuracy to predict lymph node metastasis was found in combined examination of VEGF-C and CCR7expressions with an area of 0.791under the ROC curve.Conclusion VEGF-C and CCR7play an important role in the lymph node metastasis of ovarian carcinoma.VEGF-C and CCR7act synergically in promoting tumor lymph node metastasis.Combined examination of VEGF-C and CCR7might be beneficial for judging lymph node metastasis in ovarian carcinoma.

VEGF-C；CCR7；Lymph node metastasis；Ovarian carcinoma

R737.31

A

10.3870／zgzzhx.2011.05.010

2011-04-26

2011-05-30

黑龍江省自然科學(xué)基金資助 （D201041）

夏欣，女（1985年），漢族，碩士研究生。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）