王燕妮

D-對(duì)羥基苯甘氨酸生物合成研究進(jìn)展

王燕妮

D-對(duì)羥基苯甘氨酸是β-內(nèi)酰胺類半合成抗生素藥物中間體，廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥領(lǐng)域。傳統(tǒng)的D-對(duì)羥基苯甘氨酸的合成主要是化學(xué)合成和生物酶催化法。研究人員在天藍(lán)色鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)羥基扁桃氧化酶基因(hmo)、羥基扁桃酸合酶基因(hmas)和對(duì)羥基苯甘氨酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpgt)的基因簇。人們將來自不同菌種的hmo,hmas,hpgt基因整合到大腸桿菌中，實(shí)現(xiàn)了D-對(duì)羥基苯甘氨酸的生物全合成。

D-對(duì)羥基苯甘氨酸；生物全合成；基因改造；構(gòu)型反轉(zhuǎn)

1 前言

D-對(duì)羥基苯甘氨酸(D-4-hydroxyphenylglycine)，即D-HPG，是一種白色片狀固體, 微溶于水和甲醇，易溶于酸或堿溶液生成鹽。隨著科學(xué)技術(shù)的深入發(fā)展，D-HPG作為一種重要的化學(xué)、化工、醫(yī)藥等中間體，無論在用途上還是在用量上都發(fā)生了很大變化，在國民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位，尤其在合成青霉素、頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類半合成抗生素的生產(chǎn)中有著重要的應(yīng)用。[1]但是化學(xué)合成D-HPG的方法污染較大，會(huì)產(chǎn)生氰化物，而生物全合成的方法可以有效地避免氰化物污染，同時(shí)利用生物全合成可以提高原料的利用率，簡化生產(chǎn)過程，提高轉(zhuǎn)化效率，減低生產(chǎn)成本。所以研究D-HPG生物全合成具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2 D-HPG傳統(tǒng)合成方法

國內(nèi)從八十年代開始著手研究，到九十年代中期開始小規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)初期主要是化學(xué)合成方法, 對(duì)羥基苯甲醛法(Strecker 氨基酸合成法)：[2]

圖一 Strecker 氨基酸合成法

這種方法的工藝成熟，收率較高，但由于對(duì)羥基苯甲酸的成本很高，生產(chǎn)過程中還有氰化物產(chǎn)生，毒性高，污染嚴(yán)重，污水處理復(fù)雜，這種方法現(xiàn)在已經(jīng)很少使用。

相比與化學(xué)合成，生物催化法的污染較小，反應(yīng)條件相對(duì)溫和，而且選擇性和轉(zhuǎn)化效率都有一定的優(yōu)勢。所以人們漸漸重視生物催化法的研究，主要集中在利用D, L-對(duì)羥基苯海因( D, L-HPH ) 為原料經(jīng)酶催化合成D-HPG 的方法上。首先，人們開始使用單酶法，單酶法的優(yōu)點(diǎn)是可以使底物的利用率達(dá)到100%，但還是有使用化學(xué)方法的步驟，污染嚴(yán)重問題仍是單酶法的首要限制。單酶法之后，人們相繼地研究出兩酶兩菌法，兩酶一菌法等，但都存在著生物菌種篩選困難、生物酶易失活、無法大規(guī)模生產(chǎn)等問題。

3 D-對(duì)羥基苯甘氨酸生物全合成

3.1 D-對(duì)羥基苯甘氨酸生物全合成的可能性。

2002年，Hojati等在天藍(lán)色鏈霉菌發(fā)現(xiàn)了羥基扁桃合酶基因(hmas)、羥基扁桃氧化酶基因(hmo)和對(duì)羥基苯甘氨酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpgt)的基因簇。[3]通過研究，發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因轉(zhuǎn)錄得到的酶可以將對(duì)羥基苯丙酮酸轉(zhuǎn)化成L-對(duì)羥基苯甘氨酸。

圖二 L-對(duì)羥基苯甘氨酸生物合成路徑

通過上述途徑，我們可以推斷出hmas,hmo,hpgt這三個(gè)基因很可能組成了一個(gè)獨(dú)立的操縱子。這是人們首次在生物體發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甘氨酸的合成途徑，雖然構(gòu)型是左旋的，與目標(biāo)產(chǎn)物構(gòu)型相反，但這也為實(shí)現(xiàn)其生物全合成奠定基礎(chǔ)。在Hojati研究的基礎(chǔ)上，越來越多的人著手對(duì)hmas,hmo,hpgt這三個(gè)基因的組合進(jìn)行研究了。

3.2 羥基扁桃合酶基因(hmas)。

人們?cè)谘芯可锖铣扇f古霉素類抗生素(Vancomycin Group of Antibiotics)的途徑時(shí)曾經(jīng)用到過羥基扁桃酸合酶(HMAS)，發(fā)現(xiàn)HMAS能將對(duì)羥基苯丙酮酸氧化成對(duì)羥基扁桃酸。研究發(fā)現(xiàn)HMAS與對(duì)羥基苯丙酮酸雙加氧酶(4-HPPD)在構(gòu)型和功能上有很大聯(lián)系。[4]HMAS與HPPD有43%的氨基酸堿基序列是相同的，而且還有相同的底物。當(dāng)對(duì)HPPD進(jìn)行突變時(shí)，可以得到與HMAS相同活性的酶。

2004年，Borowski等人在對(duì)HMAS進(jìn)行的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)HMAS具有與4-HPPD相同的鐵離子結(jié)合位點(diǎn)，[5]所以應(yīng)用4-HPPD的催化循環(huán)反應(yīng)模式對(duì)HMAS進(jìn)行苯羥基化活性的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，靠近鐵結(jié)合位點(diǎn)的單個(gè)氨基酸突變點(diǎn)是會(huì)影響4-HPPD產(chǎn)物特異性的，因?yàn)镠MAS就是由4-HPPD點(diǎn)突變得到的。

3.3 羥基扁桃氧化酶基因(hmo)。

1976年，Santhoor等人在研究凸形假單胞菌(Pseudomonasconvexa)時(shí)發(fā)現(xiàn)，[6]在扁桃酸代謝途徑上與其他微生物不同。在凸形假單胞菌中，芳香族扁桃酸在氧化降解的第一步是在對(duì)位上進(jìn)行羥基化，得到對(duì)羥基扁桃酸，對(duì)羥基扁桃酸又經(jīng)氧化最終得到對(duì)羥基苯甲醛。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了L-對(duì)羥基扁桃酸氧化酶(L-4-Hydroxymandelate Oxidase)。

Santhoor等人還將L-4-HMO從凸形假單胞菌中提純?cè)鋈?，并?duì)其反應(yīng)的最優(yōu)條件進(jìn)行測定：在pH是6.6，溫度為55℃時(shí)，L-4-HMO活性最大。

L-4-HMO在催化作用時(shí)需要消耗FAD，如果用FMN代替FAD，L-4-HMO只能發(fā)揮75%的活性。阿的平(對(duì)黃素依賴酶有特異性抑制作用)對(duì)上述反應(yīng)有強(qiáng)烈抑制作用。在反應(yīng)中，L-4-HMO需要二價(jià)錳離子增加酶活性。錳離子在很多反應(yīng)中都有提高酶活性的作用，大部分這樣的反應(yīng)對(duì)陽離子的選擇都是沒有特異性的，錳離子可以被其他的二價(jià)金屬離子取代。但是在L-4-HMO的反應(yīng)中，沒有任何金屬離子可以代替二價(jià)錳離子。

3.4 對(duì)羥基苯甘氨酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpgt)。

氨基酸在經(jīng)過氨基轉(zhuǎn)移酶的作用之后得出的產(chǎn)物是具有立體構(gòu)型保留性的，即左旋氨基酸轉(zhuǎn)氨基作用后還是左旋的。這種氨基轉(zhuǎn)移酶在植物和細(xì)菌中廣泛存在著。對(duì)于左旋與右旋氨基酸之間的相互轉(zhuǎn)化研究甚少。但是人們?cè)谑┦霞賳伟邪l(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甘氨酸轉(zhuǎn)移酶(4-Hydroxyphenylglycine aminotransferase)，[7]它可以完成L-谷氨酸到D-苯甘氨酸或D-對(duì)羥基苯甘氨酸的轉(zhuǎn)化。

從施氏假單胞菌中提純的HPGT與普通的轉(zhuǎn)氨酶一樣，在典型吡哆醛依賴酶抑制劑的環(huán)境下被抑制，在堿性環(huán)境中活性增強(qiáng)。它跟普通轉(zhuǎn)氨酶也有不同之處：左旋轉(zhuǎn)氨酶以左旋氨基酸為底物，產(chǎn)物為左旋氨基酸，右旋轉(zhuǎn)氨酶以右旋氨基酸為底物，產(chǎn)物為右旋氨基酸；而HPGT只將L-谷氨酸作為氨基供體，將苯乙醛酸或?qū)αu基苯乙醛酸作為氨基受體，最后得到D-苯甘氨酸或D-對(duì)羥基苯甘氨酸。在逆反應(yīng)中，HPGT只將D-苯甘氨酸或D-對(duì)羥基苯甘氨酸作為氨基供體，將α-酮戊二酸作為氨基受體，最后得到L-谷氨酸。這就是HPGT的特別之處，只有這三種底物。

圖三 HPGT的催化路徑

HPGT在反應(yīng)過程中會(huì)受到酸堿度和溫度的影響，有研究表明：[8]pH小于6時(shí)，酶活性很低，隨著堿性增強(qiáng)，酶活性越來越好，在pH為9-10之間，活性達(dá)到最大，當(dāng)pH大于10.5時(shí)，酶活性迅速下降，pH大于12時(shí)，酶失活；溫度在35到50之間，酶都具有較高的活性，溫度過高會(huì)導(dǎo)致酶失活，如果將其0度冷凍2個(gè)月，并不會(huì)對(duì)活性有太大的影響。

3.5 在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸生物合成。

天然的大腸桿菌是沒有hmas、hmo、hpgt這三個(gè)基因的，為了在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸的合成，人們把hmas,hmo,hpgt這三個(gè)不屬于大腸桿菌的基因整合到一個(gè)質(zhì)粒上，并轉(zhuǎn)到大腸里,實(shí)現(xiàn)了其合成。[9]這三個(gè)基因分類來自三個(gè)不同菌種：hpgt來自惡臭假單胞菌；hmo來自天藍(lán)色鏈霉菌；hmas來自東方擬無枝酸菌。

圖四 在大腸桿菌中構(gòu)建D-HPG的生物合成路徑

hmas、hmo兩個(gè)基因在東方擬無枝酸菌和天藍(lán)色鏈霉菌中都存在，Muller等人將兩個(gè)菌種的目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后連接到阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒上，分別導(dǎo)入大腸桿菌中，對(duì)其粗提物進(jìn)行高效色譜分析，通過對(duì)比，天藍(lán)色鏈霉菌中的HMO，東方擬無枝酸菌HMAS的活性較高，所以在構(gòu)建反應(yīng)的前兩步的基因分別來自東方擬無枝酸菌和天藍(lán)色鏈霉菌。

選定好所用的基因后，將它們一次連接到載體上，導(dǎo)入大腸桿菌中。把苯乙醛酸和L-谷氨酸作為底物，對(duì)大腸桿菌的粗提物進(jìn)行高相色譜分析發(fā)現(xiàn)，L-苯甘氨酸是不存在的。同樣，用對(duì)羥基苯乙醛酸做底物會(huì)得到D-對(duì)羥基苯甘氨酸。這說明改造后基因序列是可以表達(dá)的。

4 展望

D-對(duì)羥基苯甘氨酸作為重要的抗生素藥物中間體在醫(yī)藥領(lǐng)域需求量與日俱增，傳統(tǒng)的化學(xué)合成和生物酶催化方法不能有效平衡生產(chǎn)效率和環(huán)境污染，人們的研究方向逐漸向生物全合成轉(zhuǎn)變。Muller已經(jīng)成功構(gòu)建了合成D-HPG的基因，并在大腸桿菌中能夠表達(dá)。

生物全合成D-對(duì)羥基苯甘氨酸中用到的三個(gè)基因(hmas,hmo,hpgt)都可以在進(jìn)一步的研究中進(jìn)行優(yōu)化。在上文中提到，HMAS和HPPD的堿基序列相似度很高，甚至可以通過突變HPPD得到與HMAS相同活性的酶。我們可以將上述途徑中第一步HMAS催化過程用HPPD點(diǎn)突變產(chǎn)物來代替。同時(shí)，對(duì)比兩段基因在大腸桿菌中表達(dá)情況、兩個(gè)酶的活性、轉(zhuǎn)化效率、需要底物濃度等，可以更好地了解HMAS和HPPD的異同，以便進(jìn)一步優(yōu)化生物全合成D-對(duì)羥基苯甘氨酸途徑。

HPGT的發(fā)現(xiàn)無疑是整條生物全合成路徑中最關(guān)鍵的一步，HPGT不僅使合成路徑縮短，而且將其簡單化，D-對(duì)羥基苯甘氨酸生物全合成的可能性大大增強(qiáng)。不過HPGT對(duì)于底物的要求較高，只有三種物質(zhì)可以與其結(jié)合，這也多多少少限制一些需要構(gòu)型反轉(zhuǎn)的反應(yīng)。對(duì)于HPGT可以嘗試定點(diǎn)突變，嘗試改變底物結(jié)合位點(diǎn)，擴(kuò)大底物的接受能力。如果能得到底物限制較少的HPGT,在生物全合成中實(shí)現(xiàn)構(gòu)型反轉(zhuǎn)將不再是難事。

在合成D-對(duì)羥基苯甘氨酸的路徑中有許多副產(chǎn)品。副產(chǎn)品比較多可能是受大腸桿菌中自身的氨基轉(zhuǎn)移酶和底物的影響，研究應(yīng)該嘗試敲出一些無用基因或干擾基因，提高D-苯甘氨酸的純度，這樣也可以簡化D-苯甘氨酸的提純步驟，這些也同樣可以應(yīng)用到研究開發(fā)D-對(duì)羥基苯甘氨酸的生物全合成中。

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ClassNo.:O625DocumentMark:A

(責(zé)任編輯：鄭英玲)

ProceedingsofD-4-hydroxyphenylglycineBiosynthesis

Wang Yanni

D-4-hydroxyphenylglycine is an important medicine intermediate of β-lactam semi-synthetic antibiotics such as penicillin and cephalosporin, and is widely used in the disease treatment. The traditional methods of D-4-hydroxyphenylglycine synthesis are chemical synthesis and enzyme catalysis. Previous researches proved that there is a gene cluster that contains hydroxymandelate synthase (hmas), hydroxymandelate oxidase (hmo), and the hydroxyphenylglycine aminotransferase(hpgt) in Streptomyces coelicolor. To produce D-HPG, these three genes were combined together in E. coli strains, which resulted in the first completely fermentative production of D-HPG.

D-4-hydroxyphenylglycine; synthetic biology; genetic modification; stereo invert

王燕妮，學(xué)生，天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，天津。郵政編碼：300072

1672-6758(2011)11-0061-2

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