劉 利，胡 勇(綜述)，叢延廣(審校)

(1.解放軍第324醫(yī)院檢驗科，重慶400020;2.重慶工學(xué)院，重慶400050;3.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)微生物教研室，重慶400038)

病原菌的致病過程是與宿主細(xì)胞相互作用的復(fù)雜過程，需要許多毒力因子的協(xié)調(diào)作用。由于病原體在宿主體內(nèi)所處環(huán)境與體外有著明顯的不同，為了適應(yīng)這種環(huán)境變化，細(xì)菌會通過調(diào)節(jié)相應(yīng)的基因表達(dá)模式作出適應(yīng)性反應(yīng):即上調(diào)在宿主體內(nèi)存活中起關(guān)鍵作用的基因以及表達(dá)感染宿主所必需的基因。由此，有學(xué)者提出一個概念，即病原菌在宿主體內(nèi)表達(dá)而在體外不表達(dá)的功能基因，稱為體內(nèi)誘導(dǎo) 基 因 (in vivo-induced gene)［1］。大量的研究表明，這些獨特的在體內(nèi)表達(dá)而在體外不表達(dá)的基因往往對病原體在體內(nèi)的生存和致病有重要意義。因此，體內(nèi)誘導(dǎo)基因多數(shù)也屬于廣義的毒力基因范疇，這個廣義的毒力基因涵蓋了所有有利于致病菌在宿主體內(nèi)生存和致病的基因，由此帶來了很多系統(tǒng)篩選毒力基因的技術(shù)方法的提出和改進(jìn)，包括標(biāo)記突變技術(shù)(signature tagged mutagenesis，STM)、體內(nèi)表達(dá)技術(shù)(in vivo expression technology，IVET)、差異熒光誘導(dǎo)技術(shù)(differential fluorescence induction，DFI)和體內(nèi)誘生抗原鑒定技術(shù)(in vivo-induced antigen technology，IVIAT)等?，F(xiàn)就近年來細(xì)菌毒力基因篩選技術(shù)的新進(jìn)展綜述如下。

1 STM

STM是近年來提出并完善的一個能高通量地篩選致病菌毒力基因的方法。STM的關(guān)鍵是采用一組突變株(例如96株)同時對模型動物進(jìn)行感染，同組的每一種突變株都標(biāo)記了獨特的DNA標(biāo)簽。感染一定時間后，如果在相應(yīng)感染位點或累及組織中分離不出某個突變株，即意味著該突變株是與體內(nèi)生存和致病過程有關(guān)的關(guān)鍵基因發(fā)生了突變，成為減毒突變株，它們在宿主體內(nèi)或者不能生長、繁殖，或者不能有效定植，或者不能侵入組織，或者容易被宿主防御系統(tǒng)清除，從而因為上述種種原因被體內(nèi)環(huán)境所選擇掉。通過檢測DNA標(biāo)簽，可以確定哪些突變株是減毒突變株，進(jìn)而確定發(fā)生突變的基因。在STM中突變株的構(gòu)建和DNA標(biāo)簽的標(biāo)記是用轉(zhuǎn)座子技術(shù)同時完成的［2，3］。

STM是一種很強(qiáng)大的毒力基因研究方法，用該法篩選出的突變株，很多是與生存和致病性有關(guān)的關(guān)鍵基因發(fā)生了突變。因此，通過STM篩選致病菌的毒力基因，不僅有助于對致病機(jī)制的研究，由于這些基因?qū)Σ≡谒拗黧w內(nèi)生存和致病的重要作用，還可用于發(fā)展減毒活疫苗、蛋白亞單位疫苗，或作為抗菌藥物的作用靶子。自該方法提出后，已成功應(yīng)用到一些致病菌毒力基因的篩選研究中，包括鼠傷寒沙門菌、布氏桿菌、霍亂弧菌、鼠疫耶爾森菌等，還包括一些機(jī)會致病菌，如大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌等［3-7］。這些研究普遍都篩選到很多減毒突變株，突變基因涉及菌體表面結(jié)構(gòu)、代謝、運(yùn)輸、分泌、壓力反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及未知功能。初步研究就發(fā)現(xiàn)了一些新的毒力基因，比如涉及霍亂弧菌組織親嗜性的tcp基因，涉及不同細(xì)菌在宿主體內(nèi)增殖的purlys和trp等基因，以及與逃避抑制宿主防御系統(tǒng)有關(guān)的基因等。另外，還有大量減毒突變株突變基因的確切功能還不清楚，從而為后續(xù)工作提供了豐富的研究內(nèi)容。這些研究之所以能夠發(fā)現(xiàn)很多以前未知的基因，是因為STM作為一個高通量的篩選方法，其篩選范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了以往的研究策略。

2 IVET

應(yīng)用IVET首先需要構(gòu)建一個可以在致病菌中復(fù)制的質(zhì)粒，質(zhì)粒中攜帶有無啟動子的關(guān)鍵生長因子選擇標(biāo)志和lacZ報告基因。所謂關(guān)鍵生長因子，是指致病菌生長必需的因子，如某種氨基酸。在策略上可以將致病菌合成某種氨基酸的基因突變失活，使之成為營養(yǎng)缺陷株，當(dāng)其攜帶的質(zhì)粒中關(guān)鍵生長因子選擇標(biāo)志的上游插入合適的啟動子后，該致病菌的突變株才能在基本培養(yǎng)基中生長以及在宿主中生存繁殖。IVET的基本技術(shù)路線包括在egf/lacZ基因前面克隆插入致病菌隨機(jī)的DNA片段(其中可能包括體內(nèi)誘導(dǎo)的啟動子)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入致病菌中;再將致病菌感染動物;從感染動物體內(nèi)組織分離致病菌(其攜帶的質(zhì)粒中一定含有體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的啟動子，否則無法生長);在平板上進(jìn)行藍(lán)白篩選，篩選白色菌落(即插入的片段含有的啟動子在體外不表達(dá));最后測序和檢索，確定具有體內(nèi)誘導(dǎo)性質(zhì)的啟動子。所以本質(zhì)上，體內(nèi)表達(dá)技術(shù)直接篩選的是具有體內(nèi)誘導(dǎo)性質(zhì)的啟動子，而體內(nèi)誘導(dǎo)基因之所以具有體內(nèi)誘導(dǎo)特點，恰恰是因為其啟動子的體內(nèi)誘導(dǎo)特性，因此通過該方法可以篩選獲得致病菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因。IVET同樣是一種強(qiáng)大的方法，也已成功應(yīng)用到一些致病菌毒力基因的篩選研究中，包括鼠傷寒沙門菌、耶爾森菌、銅綠假單胞菌等［8-11］，這些研究也都獲得了豐富的結(jié)果。

3 DFI

DFI同樣采用了啟動子陷阱策略，是一種簡化了的IVET。該方法采用細(xì)胞模型，其技術(shù)路線是首先構(gòu)建一個攜帶綠色熒光蛋白基因gfp(無啟動子)的質(zhì)粒;在gfp基因前面插入致病菌隨機(jī)的DNA片段;將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入致病菌;體外培養(yǎng)后，用流式細(xì)胞儀篩選出不發(fā)熒光的致病菌(即體外不表達(dá));篩選出的致病菌感染宿主細(xì)胞;破壞細(xì)胞后釋放出感染的細(xì)菌，用流式細(xì)胞儀篩選出發(fā)熒光的致病菌(即含有體內(nèi)表達(dá)的啟動子);最后通過測序，確定啟動子及其調(diào)節(jié)的體內(nèi)誘導(dǎo)基因。

與IVET相比，DFI在技術(shù)路線上明顯簡化，不需要構(gòu)建突變株，另外，通過設(shè)置流式細(xì)胞儀篩選標(biāo)準(zhǔn)，可以檢測在體內(nèi)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的基因，也適用于測試致病菌在多種條件下的表達(dá)情況。但由于只能采用細(xì)胞模型，不適用于動物模型的篩選，因此篩選結(jié)果不夠全面，不能反映致病菌感染的全部環(huán)節(jié)。但由于操作簡便，也獲得了廣泛應(yīng)用［12-18］。

4 IVIAT

在前述的體內(nèi)誘導(dǎo)基因篩選方法中，IVET無疑是最佳的選擇。但I(xiàn)VET方法需要動物模型，不適用于沒有動物模型的致病菌研究，例如，傷寒沙門菌只對人致病，采用IVET方法就無法進(jìn)行研究。針對這種情況，最近提出了一種被稱為IVIAT的方法為傷寒沙門菌等缺乏動物模型的致病菌的體內(nèi)誘導(dǎo)基因篩選提供了一種可能。該方法的主要特點是不依賴于動物模型，而是使用實際感染患者的血清來指示病原菌在體內(nèi)的基因表達(dá)情況。其技術(shù)路線主要包括:首先利用大腸埃希菌工程菌株(如BL21)構(gòu)建致病菌的表達(dá)文庫;然后采用體外培養(yǎng)的大腸埃希菌抗原吸收處理患者的血清;再采用吸收處理后的血清做表達(dá)文庫克隆的菌落雜交篩選;對陽性克隆進(jìn)行測序和完整表達(dá)復(fù)篩［19，20］。

IVIAT法是一種優(yōu)缺點都很突出的技術(shù)。主要的優(yōu)點包括:不需要動物模型;反映與天然宿主的關(guān)系;對病原菌不需要遺傳改建;原核、真核病原體都適用;可以檢測不同感染階段的基因表達(dá)情況;技術(shù)上簡單、價格便宜。另外，IVIAT法篩選的體內(nèi)誘導(dǎo)基因產(chǎn)物有很好的免疫原性，且與細(xì)菌致病性有關(guān)，為發(fā)展傷寒的亞單位疫苗也提供了一種可能。而其主要的缺陷包括:需要患者的血清標(biāo)本;交叉反應(yīng)較常見，因此會產(chǎn)生較多假陽性;不能自動化，工作量大等。

上述4種方法特點比較見表1。從表中可以看出4種方法各有優(yōu)勢和獨特的技術(shù)特點，但是由于病原菌致病過程的復(fù)雜性，4種方法并不能完全彼此取代。在實際研究中，有必要根據(jù)實際情況進(jìn)行選擇，甚至選擇2種以上方法進(jìn)行研究。

5 結(jié)語

病原菌在致病過程中，由于是在一個不利的體內(nèi)環(huán)境中生存、繁殖，要面對宿主防御系統(tǒng)的清除作用，病原菌有必要表達(dá)一些獨特的基因確保其生存，這些基因往往只在其需要時才進(jìn)行表達(dá)或者上調(diào)表達(dá)。以往的研究方法在篩選范圍和數(shù)量上的存在局限性，使得人們對這些基因的認(rèn)識還不全面。因此以上毒力基因系統(tǒng)篩選方法的建立提供了一個更系統(tǒng)、更完整研究細(xì)菌毒力基因的好機(jī)會。

［1］ Chiang SL，Mekalanos JJ，Holden DW.In vivo genetic analysis of bacterial virulence［J］.Annu Rev Microbiol，1999(53):129-154.

［2］ Lehoux DE，Sanschagrin F，Levesque RC.Discovering essential and infection-related genes［J］.Curr Opin Microbiol，2001，4(5): 515-519.

［3］ VMecsas J.Use of signature-tagged mutagenesis in pathogenesis studies［J］.Curr Opin Microbiol，2002，5(1):33-37.

［4］ Flashner Y，Mamroud E，Tidhar A，et al.Generation of Yersinia pestis attenuated strains by signature-tagged mutagenesis in search of novel vaccine candidates［J］.Infect Immun，2004，72(2): 908-915.

［5］ Burall LS，Harro JM，Li X，et al.Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection:identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold［J］.Infect Immun，2004，72(5):2922-2938.

［6］ Lestrate P，Dricot A，Delrue RM，et al.Attenuated signature-tagged mutagenesis mutants of Brucella melitensis identified during the acute phase of infection in mice［J］.Infect Immun，2003，71(12): 7053-7060.

［7］ Lehoux DE，Sanschagrin F，Levesque RC.Identification of in vivo essential genes from Pseudomonas aeruginosa by PCR-based signature-tagged mutagenesis［J］.FEMS Microbiol Lett，2002，210(1): 73-80.

［8］ Hsiao A，Zhu J.Genetic tools to study gene expression during bacterial pathogen infection［J］.Adv Appl Microbiol，2009(67): 297-314.

［9］ Janakiraman A，Slauch JM.The putative iron transport system Sit-ABCD encoded on SPI1 is required for full virulence of Salmonella typhimurium［J］.Mol Microbiol，2000，35(5):1146-1155.

［10］ Mendez J，F(xiàn)ernandez L，Menendez A，et al.A chromosomally located traHIJKCLMN operon encoding a putative typeⅣ secretion system is involved in the virulence of Yersinia ruckeri［J］.Appl Environ Microbiol，2009，75(4):937-945.

［11］ Wang J，Mushegian A，Lory S，et al.Large-scale isolation of candidate virulence genes of Pseudomonas aeruginosa by in vivo selection［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93(19):10434-10439.

［12］ Valdivia RH，F(xiàn)alkow S.Bacterial genetics by flow cytometry:rapid isolation of Salmonella typhimurium acid-inducible promoters by differential fluorescence induction［J］.Mol-Microbiol，1996，22 (2):367-378.

［13］ Badge JL，Wass CA，Kim KS.Identification of Escherichia coli K1 genes contributing to human brain microvascular endothelial cell invasion by differential fluorescence induction［J］.Mol-Microbiol，2000，36(1):174-182.

［14］ Bartilson M，Marra A，Christine J，et al.Differential fluorescence induction reveals Streptococcus pneumoniae loci regulated by competence stimulatory peptide［J］.Mol Microbiol，2001，39(1):126-135.

［15］ Allaway D，Schofield NA，Leonard ME，et al.Use of differential fluorescence induction and optical trapping to isolate environmentally induced genes［J］.Environ-Microbiol，2001，3(6):397-406.

［16］ Schneider WP，Ho SK，Christine J，et al.Virulence gene identification by differential fluorescence induction analysis of Staphylococcus aureus gene expression during infection-simulating culture［J］.Infect Immun，2002，70(3):1326-1333.

［17］ Marra A，Asundi J，Bartilson M，et al.Differential fluorescence induction analysis of Streptococcus pneumoniae identifies genes involved in pathogenesis［J］.Infect Immun，2002，70(3):1422-1433.

［18］ McKean S，Davies J，Moore R.Identification of macrophage induced genes of Corynebacterium pseudotuberculosis by differential fluorescence induction［J］.Microbes Infect，2005，7(13):1352-1363.

［19］ Rollins SM，Peppercorn A，Young JS，et al.Application of in vivo induced antigen technology(IVIAT)to Bacillus anthracis［J］.PLoS-One，2008，3(3):e1824.

［20］ Harris JB，Baresch Bernal A，Rollins SM，et al.Identification of in vivo-induced bacterial protein antigens during human infection with Salmonella enterica serovar Typhi［J］.Infect Immun，2006，74 (9):5161-5168.