彭玲，熊筱娟

（江西省天然藥物活性成分研究重點實驗室，宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000）

里氏木霉與黑曲霉糖化油茶粕的研究

彭玲，熊筱娟

（江西省天然藥物活性成分研究重點實驗室，宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000）

對里氏木霉和黑曲霉組成混合菌糖化油茶粕進行研究。以油茶粕為主要原料，采用正交試驗對里氏木霉和黑曲霉混合菌糖化條件進行優(yōu)化。最優(yōu)糖化條件：糖化溫度為18℃，糖化時間為15 d，接種比例為2∶1（里氏木霉∶黑曲霉），接種量為6.4 mL/g，此條件下，還原糖得率為50.8%。

油茶粕；黑曲霉；里氏木霉；糖化

油茶作為我國南方丘陵地區(qū)的一種油料性植物，具有茶籽產(chǎn)量高、分布廣、品種多的優(yōu)點。油茶籽榨取茶油后剩下的茶油粕中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素和糖，能為微生物的生長提供豐富的營養(yǎng)源，油茶粕作為纖維素乙醇發(fā)酵的原料具有得天獨厚的優(yōu)勢。因此利用油茶粕生產(chǎn)燃料乙醇不僅能夠?qū)崿F(xiàn)廢物利用，同時又為推動燃料乙醇在我國的發(fā)展，緩解我國能源危機及發(fā)展可再生清潔能源提供了一條新的途徑。

根據(jù)研究得知，里氏木霉產(chǎn)纖維素酶能力強，組分比較齊全，酶活較穩(wěn)定，但是它所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶的活力比較低，分解纖維二糖的能力不夠強[1]。黑曲霉是優(yōu)良的β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)菌株，通過使用里氏木霉和黑曲霉共同培養(yǎng)、協(xié)同發(fā)酵，可以有效地緩解降解纖維素過程中因纖維二糖的積累而產(chǎn)生的反饋抑制[2-3]。采用黑曲霉與里氏木霉組成的混合菌進行油茶粕的糖化，產(chǎn)生大量可發(fā)酵糖，從而使后續(xù)油茶粕發(fā)酵產(chǎn)乙醇成為可能[4]。

本文報告以油茶粕為原料，以里氏木霉和黑曲霉為混合糖化菌，采用正交交互試驗確定里氏木霉和黑曲霉混菌糖化油茶粕的最優(yōu)條件，為進一步發(fā)酵產(chǎn)生乙醇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：黑曲霉（購于廣東省微生物菌種保藏中心）；里氏木霉（購于廣州省微生物菌種保藏中心）。

原料：油茶粕（江西省青龍集團科技有限公司提供）。

培養(yǎng)基：PDA固體（液體）培養(yǎng)基。

試劑：無水乙醇，葡萄糖，磷酸氫二鈉，檸檬酸，羧甲基纖維素鈉，鹽酸，氫氧化鈉，酒石酸鉀鈉，3，5—二硝基水楊酸，苯酚，無水亞硫酸鈉等均為分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

250B生化培養(yǎng)箱：國華企業(yè)；超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；高速中藥粉碎機：長沙市岳麓區(qū)中南制藥機械廠；新世紀(jì)紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程[5]

1.3.2 操作要點[6]

采用油茶粕為原料，對其進行預(yù)處理（70%乙醇、液固比6∶1（mL/g）、70 ℃、超聲波振蕩處理6 h）以去除所含的皂素，然后經(jīng)過洗凈、烘干等處理，稱取50 g原料，將經(jīng)過拮抗實驗、菌種活化和擴大培養(yǎng)的里氏木霉與黑曲霉，按照一定比例，接種到油茶粕當(dāng)中，放入生化培養(yǎng)箱中進行糖化，經(jīng)過一段時間后，對糖化后的油茶粕進行高溫滅菌（121℃，30 min），離心過濾，在紫外分光度儀中對濾液進行還原糖測定。

1.3.3 還原糖測定[7]

采用3，5－二硝基水楊酸（DNS）法。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.2 黑曲霉與里氏木霉拮抗實驗

在無菌操作臺上，經(jīng)高壓滅菌PDA培養(yǎng)基趁熱倒入培養(yǎng)平板中，冷卻至室溫，編號，A號培養(yǎng)皿中間接種里氏木霉，B號培養(yǎng)皿中間接種黑曲霉，C號培養(yǎng)皿相隔一定距離接種黑曲霉和里氏木霉，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，實驗結(jié)果見圖2。

由圖2-A、圖2-B可知，里氏木霉和黑曲霉在PDA培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好。由圖2-C可以明顯可看出2種菌絲相互交接，由此說明里氏木霉與黑曲霉不存在拮抗作用。里氏木霉與黑曲霉產(chǎn)生酶系存在協(xié)同關(guān)系，2種菌種混合發(fā)酵可以減少底物的抑制作用，且微生物可以保持良好產(chǎn)酶狀態(tài)。

2.3 里氏木霉與黑曲霉協(xié)同糖化正交試驗

2.3.1 試驗設(shè)計

為了優(yōu)化里氏木霉與黑曲霉協(xié)同糖化油茶粕的工藝參數(shù)，選擇糖化時間、糖化溫度、接種比例、接種量4個對糖化過程影響較大的因素設(shè)計L9（34）四因素三水平正交試驗，因素水平如表1所示。

表 1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2.3.2 正交試驗結(jié)果與分析

正交試驗結(jié)果見表2。

表 2 正交試驗結(jié)果L9（34）Table 2 Results of orthogonal test L9（34）

2.3.2.1 糖化時間的選擇

從還原糖的正交試驗結(jié)果看出，糖化的時間對油茶粕的還原糖得率影響最大。糖化時間越長，還原糖得率越高，可能的原因是由于油茶粕原料中殘留的茶皂素具有毒性，影響微生物的生長、繁殖，微生物需要比較長的時間適應(yīng)，才能產(chǎn)生足夠量的糖化酶、纖維素酶等。所以在工藝中要考慮盡可能的延長時間。所以最佳的糖化時間是15 d。

2.3.2.2 糖化溫度的選擇

就油茶粕的還原糖得率而言，正交試驗中糖化溫度是第二大影響因素。溫度的變化影響微生物的生長、繁殖和糖化力，所以最佳糖化溫度是18℃。

2.3.2.3 接種量的選擇

接種量的選擇從正交試驗結(jié)果中可以看出，試驗范圍內(nèi)接種量越大越好，可能的原因是微生物接種量越多，產(chǎn)生越多發(fā)酵所需纖維素酶量，越能縮短發(fā)酵時間。所以最佳接種量為6.4 mL/g。

2.3.2.4 接種比例的選擇

里氏木霉：黑曲霉的接種比例的選擇對還原糖得率影響最小，可能的原因是里氏木霉和黑曲霉能夠很好地協(xié)同糖化油茶粕，所以最佳接種比例為2∶1（里氏木霉：黑曲霉）。

綜上，并結(jié)合糖化實際，確定最佳糖化工藝為：A3B1D3C2，即糖化最佳時間為15d、最適糖化溫度為18℃、接種量為6.4 mL/g、里氏木霉和黑曲霉最佳接種比例為2∶1。由極差分析可知，糖化條件因素的影響主次順序為A＞B＞D＞C，即糖化時間＞糖化溫度＞接種量＞接種比例。在該條件下，油茶粕經(jīng)過糖化后，還原糖的產(chǎn)量可達到50.8%。

3 結(jié)論

1）以油茶粕為原料，利用微生物進行糖化發(fā)酵的試驗未見報道，本文對油茶粕進行糖化取得成功。

2）本文采用混合菌種里氏木霉和黑曲霉。黑曲霉和里氏木霉產(chǎn)生纖維酶是胞外酶，能更緊密與油茶粕結(jié)合，分解纖維素。里氏木霉酶系比較全，但里氏木霉所產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶活性比較低，而黑曲霉所產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活性比較高，所以里氏木霉與黑曲霉混合發(fā)酵，相互協(xié)同，可以提高纖維酶酶活性。黑曲霉與里氏木霉共生，不僅有益于酶系的改善，而且黑曲霉的生長繁殖消耗了纖維素酶促水解所生成的葡萄糖等，有益于纖維素酶的合成，提出了原料的利用價值。本文利用混合菌種里氏木霉和黑曲霉進行油茶粕糖化研究，是為后續(xù)糖化油茶粕生物發(fā)酵乙醇實驗奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

3）通過正交試驗，得出里氏木霉和黑曲霉糖化油茶粕的最佳工藝條件是：糖化最佳時間為15 d、最適糖化溫度為18℃、接種量為6.4 mL/g、里氏木霉和黑曲霉最佳接種比例為2∶1，并且在此條件下，還原糖的產(chǎn)量可達到50.8%。

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[2]高浩,湯烈貴.纖維素科學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1996：186-129

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Study on Saccharification Conditions Optimization of Aspergillus Niger and Trichoderma Reesei for Camellia Meal

PENG Ling，XIONG Xiao-juan
（Key Laboratory of Natural Medicinal Chemistry，Yichun University College of Chemistry and Bioengineering，Yichun 336000，Jiangxi，China）

To investigate saccharification of Aspergillus niger and Trichoderma reesei on Camellia meal.Using Camellia meal as raw materials，Saccharification Conditions were optimized by orthogonal test.The optimum conditions are saccharification temperature 18 ℃，saccharification time 15 days，inoculation proportion 2∶1，inoculation amount 6.4 mL/g，at this conditions，the yield is 50.8%.

camellia meal；Trichoderma reesei；Aspergillus niger；saccharification

江西省支撐計劃項目（2009BNB05600）

彭玲（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

2011-03-20