朱曉，胡斌，李景艷，劉慧博，盧蓉蓉

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫，214122)

乳酸菌表層蛋白的分離及其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)*

朱曉，胡斌，李景艷，劉慧博，盧蓉蓉

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫，214122)

對(duì)自主擁有的多株乳酸菌進(jìn)行了表層蛋白的分離和鑒定，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行了研究。采用LiCl溶液進(jìn)行提取，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，確定嗜酸乳桿菌fb116、嗜酸乳桿菌fb115和瑞士乳桿菌fb213攜帶表層蛋白。采用差示掃描量熱儀(DSC)測(cè)定，其變性溫度分別為63.67℃，61.98℃和59.78℃。它們的氨基酸組成大致相同，疏水氨基酸含量高達(dá)45%，酸性氨基酸含量在21%左右，遠(yuǎn)高于堿性氨基酸。圓二色譜法(CD)分析顯示，其二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，α-螺旋和β-折疊約占34%和12%。去除表層蛋白之后，3株菌株的自動(dòng)聚集能力和表面疏水性出現(xiàn)下降，這提示表層蛋白的存在有助于乳酸菌黏附性能的發(fā)揮。

乳酸菌，表層蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)，表面性質(zhì)，氨基酸組成

大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞壁的表面存在次晶格陣列結(jié)構(gòu)，透明、勻稱(chēng)、高度多孔且孔徑均一。這層表面結(jié)構(gòu)以非共價(jià)鍵與細(xì)胞壁結(jié)合，通常能用促溶劑鹽酸胍和離解劑LiCl溶液溶解成蛋白單體——表層蛋白(surface layer proteins)，其分子質(zhì)量為40～200 ku。在細(xì)菌細(xì)胞總蛋白中，表層蛋白的含量高達(dá)10% ～15%。除去提取劑后，表層蛋白本能地重新組裝成次晶格陣列結(jié)構(gòu)。目前認(rèn)為，表層蛋白具有保護(hù)和決定細(xì)胞形態(tài)、分子、離子肼和胞外酶的結(jié)合位點(diǎn)、細(xì)胞黏附和表面識(shí)別以及作為病原菌的毒力因子等功能［1］。

乳酸菌表層蛋白分子質(zhì)量?jī)H為25～71 ku，是分子質(zhì)量最小的一類(lèi)表層蛋白，其等電點(diǎn) pI為9.4～10.4，這是它們區(qū)別于其他表層蛋白的典型特征。表層蛋白具有多樣性，目前，只有少數(shù)表層蛋白的氨基酸序列是已知的［2-4］，對(duì)其功能了解也較少。有些乳酸菌的表層蛋白對(duì)其表面性質(zhì)有一定影響，并與它們黏附腸上皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)［5-10］。

在發(fā)酵食品(如泡菜、豆豉和酸乳)中存在著多種乳酸菌。乳酸菌是公認(rèn)的益生菌，近幾年在食品工業(yè)上得到了高度關(guān)注。由于乳酸菌和表層蛋白具有多樣性和差異性，本文旨在從自主擁有的乳酸菌資源平臺(tái)中發(fā)掘攜帶表層蛋白的乳酸菌，研究這些表層蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，探討它們?cè)谌樗峋嫔再|(zhì)中發(fā)揮的作用機(jī)制，為這些乳酸菌的實(shí)踐應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 菌種

嗜酸乳桿菌fb115(Lactobacillus acidophilus fb115)、嗜酸乳桿菌 fb116(Lactobacillus acidophilus fb116)、瑞士乳桿菌 fb213(Lactobacillus helveticus fb213)、干酪乳桿菌 fb34(Lactobacillus casei fb34)、植物乳桿菌N34(Plant lactobacillus N34)、植物乳桿菌N29(Plant lactobacillus N29)、兩歧雙歧桿菌fb35(Bifidobacterium bifidum fb35)、鼠李糖乳桿菌 fb36(Lactobacillus rhamnosus fb36)，由江南大學(xué)食品學(xué)院食品生物技術(shù)研究中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖40 g/L，乙酸鈉10 g/L，無(wú)水MgSO40.048 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，檸檬酸氫二銨 2 g/L，KH2PO4·3H2O 2.68 g/L，吐溫 80 2.0 mL/L，pH 6.2 ～6.4;MRS 固體培養(yǎng)基:在 MRS 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂粉15 g/L。

1.3 試劑

SDS-PAGE低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker(14.4～97.4 ku)，中科院上海生物化學(xué)研究院;牛血清清蛋白，上海華美生物工程公司;0.22 μm混合纖維素濾膜，上海興亞凈化材料廠(chǎng);透析袋，截留分子質(zhì)量14 ku，上海綠鳥(niǎo)科技有限公司;其它試劑均為分析純。

1.4 儀器與設(shè)備

Minispin plus高速離心機(jī)，德國(guó)EPPENDORF公司;Avanti J-26 XP高速冷凍離心機(jī)，BECKMAN COULTER公司;DKY-II恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床，上海杜科自動(dòng)化設(shè)備有限公司;GRP 9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;DYY-IIB三恒電泳儀，北京市六一儀器廠(chǎng);GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-rad伯樂(lè)公司;UV-1100

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司;6 L落地式凍干機(jī)，美國(guó)LABCONCO公司;DSC-7差示掃描量熱儀，Perkin Elmer公司;SYNAPT MS液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)WATERS公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 菌株的活化和傳代

將已活化的乳酸菌轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基中，接種量為20 mL/L。于37℃恒溫培養(yǎng)18 h至對(duì)數(shù)末期，傳接3代，留取第3代的菌液。離心(5 000 r/min，4 ℃，15 min)收集菌體，用0.01 mol/L 無(wú)菌的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 7.2)重懸洗滌2次，制備菌懸液備用。

1.5.2 菌體全蛋白和表層蛋白的提取

參考Garrote等［11］的方法并作適當(dāng)改動(dòng)。離心(5 000 r/min，4 ℃，15 min)收集菌體，加入1/10 體積的10 g/L SDS溶液，混勻，煮沸10 min。離心(12 000 r/min，4℃，15 min)收集上清液，得到菌體全蛋白提取液，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

提取表層蛋白時(shí)，收集菌體后，用1/10體積的5 mol/L LiCl溶液，在37℃、180 r/min的搖床中處理60 min，再進(jìn)行離心。其他處理方式同上。取部分上清液于透析袋中，每2 h換水1次至完全透析。凍干。凍干物保存于-20℃，備用。

1.5.3 SDS-PAGE 電泳分析

分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，起始電壓80 V，溴酚藍(lán)前緣進(jìn)入分離膠后150 V，進(jìn)行蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)R-250染色。鑒定實(shí)驗(yàn)菌株是否攜帶表層蛋白。

1.5.4 表層蛋白的變性溫度分析

采用差示掃描量熱儀(DSC)進(jìn)行分析［12］。稱(chēng)取2～4 mg蛋白質(zhì)凍干物于鋁盒中壓片，記錄樣品質(zhì)量。設(shè)定溫度區(qū)間為30～130℃，升溫速率為10℃/min。

1.5.5 表層蛋白的氨基酸組成分析

采用酸水解法，利用液相串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)測(cè)定除色氨酸以外的氨基酸含量。

1.5.6 表層蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

采用圓二色譜法。樣品濃度:0.01～0.2 g/L，掃描波長(zhǎng)范圍:190～250 nm，掃描速率:100 nm/min，光程:l mm。掃描平行3次。

1.5.7 菌株自動(dòng)聚集能力分析

參考Chen等人［13］的方法，并作適當(dāng)改動(dòng)。調(diào)整菌懸液濃度至約108CFU/mL。取2 mL上層菌懸液，混勻15 s，室溫下放置4 h后測(cè)定600 nm吸光度。自動(dòng)聚集能力百分比計(jì)算公式:

式中:A0表示最初菌懸液在600 nm的吸光度;A4表示4 h時(shí)菌懸液在600 nm的吸光度。

1.5.8 表面疏水性分析

參考Kos等人［8］的方法，并做適當(dāng)修改。調(diào)整菌懸液濃度至約108CFU/mL，測(cè)定其在600 nm下的吸光度，記為A0。取3 mL調(diào)整濃度后的菌液，加入1 mL二甲苯，振蕩5 min，靜置30 min，等待分層。取水相，在600 nm下測(cè)定A1。細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性計(jì)算公式:

式中:A0表示最初菌懸液在600 nm的吸光度;A1表示分層后水相菌懸液在600 nm的吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

文中數(shù)據(jù)為3次平行測(cè)定值的平均值。顯著性分析采用SPSS 16.0○R(美國(guó) SPSS公司)的單因素方差分析(One-Way ANOVA，Turkey)在顯著性水平P=0.05下進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果和討論

2.1 攜帶表層蛋白的乳酸菌的初篩

根據(jù)報(bào)道，嗜酸乳桿菌表層蛋白分子質(zhì)量在41～49 ku［1，14-15］，瑞士乳桿菌表層蛋白分子質(zhì)量在 43 ～52 ku［9，16-17］左右。由圖 1 和圖 2 可以看出，分子質(zhì)量40～70 ku內(nèi)，只有嗜酸乳桿菌fb115、嗜酸乳桿菌fb116以及瑞士乳桿菌fb213的LiCl提取物和SDS提取物在45～66 ku內(nèi)有主要的蛋白條帶，均大于45 ku，可判斷這3株乳桿菌攜帶表層蛋白。

2.2 表層蛋白的熱變性溫度

嗜酸乳桿菌fb116、嗜酸乳桿菌fb115和瑞士乳桿菌fb213的表層蛋白凍干物的DSC分析圖譜分別見(jiàn)圖3，這3種表層蛋白的變性溫度 Tm分別為(63.67 ±0.28) ℃，(61.98 ± 0.67) ℃ 和(59.78 ±0.85) ℃。

圖3所示，3株乳桿菌表層蛋白的DSC曲線(xiàn)均只出現(xiàn)了1個(gè)吸熱峰，峰形較為對(duì)稱(chēng)。相比有些乳酸菌的表層蛋白有2個(gè)變性溫度，一個(gè)在57～70℃，一個(gè)在98～118℃［12］，3株乳桿菌的表層蛋白的熱變性溫度比文獻(xiàn)報(bào)道值略低，這與表層蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子質(zhì)量、輕重鏈長(zhǎng)度比例以及氨基酸組成等因素有關(guān)。這進(jìn)一步驗(yàn)證了不同菌株之間表層蛋白的差異性。

圖1 LiCl提取表層蛋白和SDS提取細(xì)胞全蛋白的SDS-PAGE圖譜

圖2 LiCl提取表層蛋白和SDS提取細(xì)胞全蛋白的SDS-PAGE圖譜

圖3 3株乳酸菌表層蛋白的DSC熱變性圖譜

表1 3株乳酸菌表層蛋白的氨基酸組成 %

2.3 表層蛋白的氨基酸組成

蛋白質(zhì)的氨基酸組成影響著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性等理化性質(zhì)以及功能。3株乳酸菌的表層蛋白凍干物的氨基酸組成結(jié)果分別如表1所示。

由表1可知，3株乳酸菌的表層蛋白的氨基酸組成大致相近:帶羥基氨基酸含量達(dá)15%左右;疏水氨基酸含量高達(dá)45%左右，稍高于表層蛋白的平均水平［1］;酸性氨基酸含量在21%左右，遠(yuǎn)高于堿性氨基酸;堿性氨基酸中賴(lài)氨酸含量最高，達(dá)8% ～10%;組氨酸、精氨酸和蛋氨酸含量也較低，半胱氨酸幾乎沒(méi)有。高含量的酸性氨基酸使乳酸菌表層蛋白的等電點(diǎn)pI偏堿性。此外，含硫氨基酸含量很低，推測(cè)這3種表層蛋白的二硫鍵很少，維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用力則主要為非共價(jià)鍵。

2.4 表層蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

表2顯示，3株乳酸菌的表層蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成具有高度的相似性;均表現(xiàn)為α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲的含量較高，α-折疊和 β-轉(zhuǎn)角所占的比例較低。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［1］，乳酸菌表層蛋白平均大約有20%的氨基酸形成了α-螺旋，40%形成β-折疊，而形成的無(wú)規(guī)卷曲和α-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)則在5% ～45%之間變化。3株實(shí)驗(yàn)菌株的表層蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的β-折疊的含量較文獻(xiàn)報(bào)道［1，12］的偏低，而 α-螺旋含量較文獻(xiàn)報(bào)道［1，12］要高出很多，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例組成恰能說(shuō)明3株乳酸菌的熱變性溫度比文獻(xiàn)報(bào)道的偏低，低含量的β-折疊使蛋白質(zhì)更容易在較低的溫度下熱變性。

此外，α-螺旋、β-折疊的比例與氨基酸組成有關(guān)。通常，高含量的谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸有利于α-螺旋的形成，而纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸則有利于形成β-折疊。以瑞士乳桿菌fb213的表層蛋白為例，谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸含量之和為21.77%，高于纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸的含量之和17.52%，這可以部分解釋其α-螺旋多于β-折疊的現(xiàn)象。另外兩種表層蛋白也類(lèi)似。

表2 3株乳桿菌的表層蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.5 表層蛋白對(duì)菌株表面性質(zhì)的影響

乳酸菌表面性質(zhì)中的表面疏水性和自動(dòng)聚集能力通常被認(rèn)為是兩個(gè)獨(dú)立、能夠反映菌株黏附能力的特征。

2.5.1 表層蛋白對(duì)菌株自動(dòng)聚集的影響

自動(dòng)聚集是微生物之間的相互作用，對(duì)于一些益生菌來(lái)說(shuō)，自動(dòng)聚集是黏附腸上皮細(xì)胞或與病原菌共聚集形成保護(hù)屏障而阻止病原菌的第一步［18］，測(cè)定去除表層蛋白前后菌株自動(dòng)聚集能力的變化可驗(yàn)證它們是否參與了這一過(guò)程［19］。如表3所示，經(jīng)過(guò)5 mol/L的LiCl溶液處理之后，破壞了菌體的表層，去除了大量表層蛋白之后，3株實(shí)驗(yàn)菌株的自動(dòng)聚集能力大約下降了12% ～23%。這表明，表層蛋白或完整的表層參與了菌體細(xì)胞的自動(dòng)聚集過(guò)程，進(jìn)而可能參與了菌體細(xì)胞的對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附，使得菌株得

以定植于腸道，抑制病原菌的黏附。

2.5.2 表層蛋白對(duì)菌株表面疏水性的影響

嗜酸乳桿菌fb116、嗜酸乳桿菌fb115和瑞士乳桿菌fb213經(jīng)LiCl處理、去除表層蛋白前后，菌株的表面疏水性變化見(jiàn)表3。嗜酸乳桿菌fb115和瑞士乳桿菌fb213在去除表層蛋白之后，其表面疏水性顯著下降，表明它們的表層蛋白對(duì)菌株的表面疏水性有所貢獻(xiàn)。疏水性的強(qiáng)弱主要取決于細(xì)菌表面非極性基團(tuán)的多少，與脂磷壁酸等結(jié)構(gòu)也有關(guān)。嗜酸乳桿菌fb116在去除表層蛋白之后，其表面疏水性反而升高，可能因?yàn)槌ケ韺拥鞍缀舐懵兜募?xì)胞壁表面疏水性更強(qiáng)。這也體現(xiàn)了表層蛋白的菌株特異性。表層蛋白影響了菌株的表面疏水性，后者與菌株的黏附能力相關(guān)［20］。初步推斷，嗜酸乳桿菌fb115和瑞士乳桿菌fb213的表層蛋白可能影響菌株的黏附性質(zhì)。

表3 菌株的表面性質(zhì)分析

3 結(jié)論

從自主擁有的乳酸菌資源平臺(tái)中篩選了3株攜帶表層蛋白的乳桿菌，分別為嗜酸乳桿菌fb116、嗜酸乳桿菌fb115和瑞士乳桿菌fb213。3種表層蛋白的變性溫度分別為 63.67，61.98，59.78 ℃。它們的氨基酸組成大致相同，二級(jí)結(jié)構(gòu)也具有高度的相似性，α-螺旋和β-折疊約占34%和12%，無(wú)規(guī)則卷曲約占33%，結(jié)構(gòu)較為松散，導(dǎo)致變性溫度較低。鑒于菌株的表面性質(zhì)與黏附性質(zhì)的強(qiáng)相關(guān)性，初步推測(cè)，這3株乳酸菌的表層蛋白可能與其黏附性質(zhì)也有關(guān)，利于菌株益生功能的發(fā)揮。

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Surface Layer Proteins of Lactobacillus:Isolation，Structure and Properties

Zhu Xiao，Hu Bin，Li Jing-yan，Liu Hui-bo，Lu Rong-rong
(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

In the present study several lactobacillus carrying surface layer proteins had been screened from those owned by our laboratory.They were Lactobacillus acidophilus fb116，Lactobacillus acidophilus fb115 and Lactobacillus helveticus fb213.The thermal analysis of the lyophilized surface layer proteins were performed by differential scanning calorimetry(DSC).DSC analysis showed one phase transition with maxima located at ca.63.67℃，61.98 ℃and 59.78 ℃ for these three proteins.The amino acid compositions of the three proteins were determined mostly the same，which had a high content(45%)of hydrophobic amino acids and a higher content(24%)of acidic amino acids then basic ones.By circular dichrosim(CD)spectra the secondary structures of the proteins were predicted to be composed similarly of 34%alpha-helix and 12%beta-sheet.After removal of surface layer proteins，the autoaggregation percentage and the cell surface hydrophobicity of the three lactobacillus were reduced.It was implied that the surface layer proteins played a role in adhesion property of Lactobacillus.

Lactobacillus，surface layer proteins，secondary structure，surface properties，amino acid composition

碩士(盧蓉蓉教授為通訊作者，E-mail:lurr@jiangnan.edu.cn)。

*教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃(NCET-09-0436);國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31071491)

2011-07-26，改回日期:2011-08-07