劉全德，劉恩岐，陳尚龍，鄭毅，王鋒，黃小冬

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇徐州，221008)

微波消解-石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定蛋白質(zhì)粉中鎘*

劉全德，劉恩岐，陳尚龍，鄭毅，王鋒，黃小冬

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇徐州，221008)

建立了采用微波消解，基體改進(jìn)劑輔助石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定蛋白質(zhì)粉中鎘的方法。研究了樣品中磷酸二氫銨的質(zhì)量濃度，灰化溫度以及原子化溫度對(duì)吸光度的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)化確定了最佳測(cè)定條件為:磷酸二氫銨的質(zhì)量濃度為3.51 mg/mL、灰化溫度為564℃、原子化溫度為1 893℃。在此條件下，測(cè)定蛋白質(zhì)粉中鎘的含量為0.238μg/g，精密度為2.77%，檢出限為0.21 ng/mL，加標(biāo)平均回收率為99.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.82%。

微波消解，基體改進(jìn)劑，石墨爐原子吸收光譜法(GFAAS)，蛋白質(zhì)粉，鎘

微波消解是利用微波能使消解體系中的極性分子在微波電磁場(chǎng)的高頻作用下做極性運(yùn)動(dòng)，從而引起化學(xué)鍵的振動(dòng)、斷裂及微粒的相互摩擦、碰撞，產(chǎn)生大量的熱，達(dá)到快速、完全消解的目的［1］。與常用的濕法消解和干法灰化［2－5］相比，微波消解具有快速、準(zhǔn)確、省試劑、污染少、空白低等優(yōu)點(diǎn)［6－9］。

鎘是對(duì)人體有害的蓄積性毒物，其污染通過(guò)食物鏈傳遞、富集和放大。進(jìn)入人體內(nèi)的鎘大部分會(huì)蓄積在腎臟和肝臟，可引起腎臟慢性中毒，高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化，甚至產(chǎn)生致畸致突變作用［10］。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

紐崔萊蛋白質(zhì)粉(產(chǎn)品編號(hào)20007)，安利(中國(guó))日用品有限公司;濃硝酸、磷酸二氫銨，均為優(yōu)級(jí)純;檸檬酸，抗壞血酸、十二烷基硫酸鈉、硫酸銨，酒石酸、30%過(guò)氧化氫，均為分析純;鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為1 mg/mL)，購(gòu)于國(guó)家化學(xué)試劑質(zhì)檢中心;實(shí)驗(yàn)用水皆為超純水(電阻率:18.2Ω·cm);玻璃器皿均用5%硝酸浸泡＞24 h。

1.2 儀器與設(shè)備

TAS-990原子吸收分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;氬氣＞99.99%;XT-9900型智能微波消解儀和XT-9800多用預(yù)處理加熱儀，上海新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司;CascadaTM實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)。FA-2004B電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司;eppendorf移液器，德國(guó)艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 儀器工作條件和石墨爐加熱程序

石墨爐原子吸收分光光度計(jì)工作條件見(jiàn)表1，石墨爐加熱程序見(jiàn)表2。

表1 石墨爐原子吸收分光光度計(jì)工作條件

表2 石墨爐加熱程序

1.3.2 基體改進(jìn)劑溶液的配制

分別稱取2.50g檸檬酸，磷酸二氫銨，抗壞血酸，十二烷基硫酸鈉，硫酸銨，酒石酸于50 mL容量瓶中，用0.15 mol/L HNO3定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的基體改進(jìn)劑溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制

用0.15 mol/L HNO3將鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋至質(zhì)量濃度為50 ng/mL的鎘標(biāo)準(zhǔn)使用液。取6只10 mL容量瓶，分別加入0.702 mL磷酸二氫銨溶液，然后在各容量瓶中依次加入鎘標(biāo)準(zhǔn)使用液0.1，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6 mL，用0.15 mol/L HNO3定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.5、1、2、4、6、8 ng/mL 的鎘標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按試驗(yàn)方法配制空白溶液。

1.3.4 樣品處理方法

準(zhǔn)確稱取0.300 0 g左右的蛋白質(zhì)粉于干燥的聚四氟乙烯微波消解罐中，加入5 mL濃HNO3、1 mL 30%過(guò)氧化氫，于多用預(yù)處理加熱儀中敞口消解1h后(溫度:40～100℃逐步加熱)。取出再加入1 mL 30%過(guò)氧化氫，按表3中微波消解條件進(jìn)行消解，微波消解完成后得到無(wú)色透明溶液，轉(zhuǎn)移至50 mL小燒杯中，將小燒杯放到電子電爐上，調(diào)節(jié)電爐功率至1 000 W，在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱趕酸至近干，用0.15 mol/L HNO3多次沖洗小燒杯中的樣液，并將沖洗液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用0.15 mol/L HNO3定容至刻度，搖勻備用。按試驗(yàn)方法做空白試驗(yàn)。

表3 微波消解條件

在1只10 mL容量瓶中，加入5 mL微波消解溶液和 0.702 mL磷酸二氫銨溶液，用 0.15 mol/L HNO3定容至刻度，搖勻待測(cè)。按試驗(yàn)方法配制空白溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 基體改進(jìn)劑的選擇及其質(zhì)量濃度對(duì)吸光度的影響

在石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定微量元素過(guò)程中，基體改進(jìn)劑及其質(zhì)量濃度的選擇非常重要［11］。比較檸檬酸，磷酸二氫銨，抗壞血酸，十二烷基硫酸鈉、硫酸銨和酒石酸這6種基體改進(jìn)劑對(duì)吸光度的影響后，發(fā)現(xiàn)磷酸二氫銨的增敏效果最顯著，同時(shí)對(duì)吸收峰的峰形也有改善。在固定其他條件下，只改變樣品中磷酸二氫銨的質(zhì)量濃度，測(cè)定其吸光度，結(jié)果如圖1。

圖1 磷酸二氫銨的質(zhì)量濃度對(duì)吸光度的影響

由圖1可知，當(dāng)樣品中磷酸二氫銨的質(zhì)量濃度低于3.0 mg/mL時(shí)，吸光度隨質(zhì)量濃度的增加逐漸升高;當(dāng)樣品中磷酸二氫銨的質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時(shí)，吸光度達(dá)到最大值，此后隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸降低。

2.1.2 灰化溫度對(duì)吸光度的影響

在石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定微量元素過(guò)程中，灰化溫度是影響測(cè)定結(jié)果比較明顯的因素之一。在固定其他條件下，只改變灰化溫度，測(cè)定其吸光度，結(jié)果如圖2。

圖2 灰化溫度對(duì)吸光度的影響

由圖2可知，當(dāng)灰化溫度低于600℃時(shí)，吸光度隨灰化溫度的增加逐漸升高，灰化溫度低于600℃時(shí)，灰化不完全，導(dǎo)致吸光度偏低;當(dāng)灰化溫度為600℃時(shí)，吸光度達(dá)到最大值，此后隨著溫度的增加逐漸降低。

2.1.3 原子化溫度對(duì)吸光度的影響

在石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定微量元素過(guò)程中，原子化溫度也是影響測(cè)定結(jié)果比較明顯的因素之一。在固定其他條件下，只改變?cè)踊瘻囟?，測(cè)定其吸光度，結(jié)果如圖3。

圖3 原子化溫度對(duì)吸光度的影響

由圖3可知，當(dāng)原子化溫度低于1900℃時(shí)，吸光度隨原子化溫度的增加逐漸升高;當(dāng)原子化溫度為1 900℃時(shí)，吸光度達(dá)到最大值，此后隨著溫度的增加逐漸降低。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)

根據(jù) Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［12－13］，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇磷酸二氫銨的質(zhì)量濃度、灰化溫度、原子化溫度為影響因素，以吸光度為響應(yīng)值，采用三因素三水平的響應(yīng)曲面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為分析因子(1～12)，3個(gè)中心試驗(yàn)點(diǎn)(13～15)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表4，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 Box-Benhnken試驗(yàn)因素水平表

2.2.1 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

利用Design expert.8.05b統(tǒng)計(jì)軟件通過(guò)逐步回歸對(duì)表5中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得吸光度對(duì)以上3個(gè)因素的二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型:

吸光值 =0.19+4.5×10－3x1－7.125×10－3x2－8.750×10－4x3－4.250×10－3x1x2+1.750×10－3x1x3+2.0×10－3x2x3－5.750 ×10－3x12－0.013 x22－5.0×10－3 x32對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表6 響應(yīng)曲面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果

由表6可知，該模型具有高度的顯著性(P＜0.01)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.060 9 ＞0.05)，R2Adj=0.907 9和Adeq.Precision(信噪比)為10.296遠(yuǎn)大于4，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，試驗(yàn)誤差較小，故可用此模型對(duì)微波消解-石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定蛋白質(zhì)粉中鎘的最佳測(cè)定條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程，作響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析磷酸二氫銨的質(zhì)量濃度、灰化溫度和原子化溫度對(duì)吸光度的影響。響應(yīng)曲面及其等高線如圖4～圖6，3組圖直觀地反映了各因素對(duì)吸光度的影響。

等高線的形狀反映因素之間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。為了進(jìn)一步確定最佳測(cè)定條件，對(duì)所得回歸方程求一階偏導(dǎo)，并令其為0，得優(yōu)化后的最佳測(cè)定條件為:磷酸二氫銨的質(zhì)量濃度為3.51 mg/mL、灰化溫度為564℃、原子化溫度為1 893℃，此時(shí)理論預(yù)測(cè)吸光度為0.194。

圖4 磷酸二氫銨的質(zhì)量濃度和灰化溫度對(duì)吸光度影響的響應(yīng)面和等高線

圖5 磷酸二氫銨的質(zhì)量濃度和原子化溫度對(duì)吸光度影響的響應(yīng)面和等高線

圖6 灰化溫度和原子化溫度對(duì)吸光度影響的響應(yīng)面和等高線

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，在2.2.2優(yōu)化出的最佳測(cè)定條件下測(cè)定6次，實(shí)際測(cè)得的平均吸光度為0.196，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.71%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差為1.03%。表明基于Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得的最佳測(cè)定條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢出限

按最佳測(cè)定條件，測(cè)定鎘標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得線性回歸方程見(jiàn)表7。對(duì)空白溶液進(jìn)行連續(xù)12次測(cè)定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率(b)，由3σ/b計(jì)算出檢出限［14］見(jiàn)表7。

表7 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢出限

由表7可知，在確定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，鎘的質(zhì)量濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，儀器的檢出限為0.21 ng/mL，滿足測(cè)定蛋白質(zhì)粉中鎘的要求。

2.4 樣品測(cè)定和精密度

按1.3.4方法平行配制6個(gè)樣品溶液，在最佳測(cè)定條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 蛋白質(zhì)粉中鎘含量

由表8可知，蛋白質(zhì)粉中鎘含量為0.238μg/g，本法的精密度(RSD)=2.77%，表明用本法測(cè)定蛋白質(zhì)粉中鎘，結(jié)果有較好的穩(wěn)定性，滿足測(cè)定蛋白質(zhì)粉中鎘的要求。

2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

表9 加標(biāo)回收率測(cè)定［15］

由表9可知，加標(biāo)回收率在97.6% ～102.8%之間，平均值為99.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.82%，表明用本法測(cè)定蛋白質(zhì)粉中鎘，準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化蛋白質(zhì)粉中鎘的測(cè)定條件。優(yōu)化后得到最佳測(cè)定條件為:磷酸二氫銨的質(zhì)量濃度為3.51 mg/mL、灰化溫度為564℃、原子化溫度為1 893℃。在此條件下，測(cè)定蛋白質(zhì)粉中鎘的含量為0.238μg/g，精密度為2.77%，檢出限為0.21ng/mL，加標(biāo)平均回收率為99.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.82%。

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Determination of Cadmium in Protein Powder by Microwave Digestion-GFAAS

Liu Quan-de，Liu En-qi，Chen Shang-long，Zheng Yi，Wang Feng，Huang Xiao-dong
(College of Food Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221008，China)

An effective method was developed for determination of cadmium in protein powder by microwave digestion －GFAAS with matrix modifier．The effects of NH4H2PO4mass concentration in tested sample，ashing temperature and atomizing temperature on absorption was discussed．The optimal determination conditions were found by response surface methodology as follows:NH4H2PO4mass concentration 3．51 mg/mL;ashing temperature 564℃;and atomizing temperature 1 893℃．Under the above conditions，the content of cadmium in protein powder was 0．238 μg/g，the precision relative standard deviation was 2．77%，the detection limit was 0．21 ng/mL，and the average recovery of cadmium in protein powder was 99．5%with a relative standard deviation of 2．82%．

microwave digestion，matrix modifier，graphite flame atomic absorption spectrophotometry，protein powder，cadmium

學(xué)士，副教授。

*江蘇省高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目(10KJD550004)

2011－06－20，改回日期:2011－09－01