倪向梅，曹光群

江南大學化學與材料工程學院，無錫214122

竹葉提取物的體外抑菌及抗氧化活性的研究

倪向梅，曹光群*

江南大學化學與材料工程學院，無錫214122

本文用水提取竹葉有效成分，將提取液濃縮至含生藥量約1.0 g/mL，經(jīng)醇沉后取清液濃縮，再經(jīng)石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分步萃取，得不同極性的各部分提取物。以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為供試菌，采用抑菌圈法(瓊脂擴散法)和最低抑菌濃度(MIC)法測定其抑菌效果。結果顯示，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯部分均表現(xiàn)抑菌活性。各供試樣對兩種菌的抑菌圈直徑達9.8～18.4 mm，最低抑菌濃度分別為1.25 mg/ mL，2.50 mg/mL和5.00 mg/mL。最后采用亞硝基紅鹽-Co2+褪色法研究了竹葉提取物對·OH的清除作用，結果表明三氯甲烷和乙酸乙酯部分萃取物的抗氧化性明顯優(yōu)于水提物，其中乙酸乙酯部分萃取物的IC50值為1.06 mg/mL。

竹葉提取物;抑菌活性;抗氧化性;自由基清除

化妝品中使用的各種原料和添加劑多數(shù)易受微生物侵蝕而導致產(chǎn)品變質(zhì)，隨著消費者對產(chǎn)品安全意識的增強，化妝品防腐問題越來越受到重視。對羥基苯甲酸酯類是目前應用于個人護理產(chǎn)品最廣泛的防腐劑之一，Routledge等人［1］的研究首次發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲酸酯具有雌激素活性，會對消費者的身心健康帶來不利。因而，從天然產(chǎn)物中尋找高效低毒的新抑菌劑替代合成防腐劑已成為中草藥的研究方向之一。

中國素有“竹子王國”之稱，種類、面積和竹材產(chǎn)量均占世界1/3左右。但相對于竹木和竹筍的利用來說，竹葉作為剩余產(chǎn)物往往被舍棄，造成了極大的資源浪費。近年來，大量研究表明竹葉中含有黃酮類、酚酸類、蒽醌類化合物、生物活性多糖、氨基酸肽類、萜類內(nèi)酯等活性成分［2］，具有顯著的抗自由基、抗氧化、抗菌抗病毒等生理活性。最早由李惠珍等［3］發(fā)現(xiàn)竹葉具有優(yōu)良的防腐性能，能加入食品作為天然的食品保鮮劑、防腐劑，穩(wěn)定性好，毒性小。

近年來，有關竹葉提取物的抑菌和抗氧化作用已有不少研究報道。但對竹葉提取物抑菌作用的研究僅停留在比較不同溶劑提取或不同提取條件下得到提取物的抑菌效果［4，5］，抗氧化性研究主要考察竹葉乙醇提取物對自由基的清除以及抗脂質(zhì)氧化［6］的作用，馬世玉［7］等人的研究表明竹葉水提液能提高心、腦組織及全血中抗氧化酶的活性，抑制自由基損傷，防止脂質(zhì)過氧化。

本實驗采用水作溶劑提取竹葉有效成分，將水提液經(jīng)乙醇沉淀預處理后，用四種有機溶劑萃取得到極性不同的五個部分，分別對竹葉各萃取物進行抑菌活性以及清除自由基能力的研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SW-CJ-1G型單人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司);SPX-250型生化培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠);DSX-280A型不銹鋼高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);DZF-6020型真空干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市榮華儀器制造有限公司);TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 材料

原料:竹葉于2009年6月采于浙江龍游溪口鎮(zhèn)，干燥后備用，經(jīng)南京野生植物綜合利用研究院植物資源化學研究室鑒定為毛竹(Phyllostachys pubescens Mazel ex H.de Leh.)竹葉;

試劑與藥品:石油醚(60～90℃)、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、硫酸鈷(CoSO4·7H2O)、亞硝基紅鹽(分析純，國藥集團化學試劑有限公司);無水碳酸鈉(分析純，上海虹光化工廠);碳酸氫鈉(分析純，濟南化工廠分廠);過氧化氫(分析純，上海桃浦化工廠);對羥基苯甲酸乙酯(化學純，中國醫(yī)藥集團化學試劑有限公司)、BHT(化學純，國藥集團化學試劑有限公司)

菌種:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Sa)、大腸桿菌(Escherichia coli，Ec)由江南大學食品學院微生物實驗室提供

培養(yǎng)基:蛋白胨牛肉膏培養(yǎng)基［8］:蛋白胨10 g，牛肉浸膏3 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，去離子水1000 mL。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.5;121℃，0.15 MPa下濕熱滅菌20 min

2 試驗方法

2.1 竹葉水提物及溶劑萃取物的制備

具體提取流程見下圖:

圖1 竹葉提取工藝流程Fig.1 The flow chart for extraction technics of bamboo leaves

2.2 抑菌活性試驗方法

2.2.1 供試菌懸液及樣品的制備

菌種活化:將供試菌種接種于固體培養(yǎng)基斜面，于37℃下培養(yǎng)活化24 h。

制備供試菌懸液:取一環(huán)活化供試菌于裝有50 mL無菌液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃下培養(yǎng)12～18 h，制得初始菌懸液。用無菌生理鹽水按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的順序依次梯度稀釋成5個濃度，各取200 μL涂布平板，37℃放置24 h后計數(shù)，直至將菌懸液調(diào)為合適的濃度，作為供試菌懸液。

對照品溶液的制備:準確稱取0.1 g對羥基苯甲酸乙酯，溶于0.5 mL無水乙醇，制得0.2 g/mL對照品溶液。

供試樣品溶液的制備:將上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部分萃取物浸膏，視溶解性分別用適當溶劑溶解，仿照對照品溶液的制備方法配制成0.2 g/mL濃度。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ用相應萃取溶劑溶解，Ⅴ用水溶解;實驗中發(fā)現(xiàn)Ⅲ部分浸膏在乙酸乙酯中溶解性并不好，故選擇50%乙醇作為溶劑。

2.2.2 抑菌圈法(瓊脂擴散法)［9］

將20 mL滅菌瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿制平板，冷卻后注入上述1×106CFU/mL菌懸液200 μL，用無菌棒涂抹展開至培養(yǎng)基表面。取直徑6 mm的濾紙片，放入樣品溶液中浸泡30 min，取出晾干后貼在含菌平板上，每皿3片對照，每個濃度平行作2皿。同時將濾紙片浸在各樣品溶劑中，作同步抑菌實驗進行空白對照。將培養(yǎng)皿倒扣，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，測量抑菌圈直徑，每個抑菌圈在垂直方向上測兩次取平均值。抑菌圈越大，表示抑菌效果越好。

2.2.3 最低抑菌濃度(MIC)法

以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為供試細菌，先按2.2.1的方法將供試菌懸液濃度調(diào)為5×104～5 ×105CFU/mL［10］。根據(jù)2.2.2的實驗結果，將顯示明顯抑菌圈的樣品進行MIC值的測定。實驗分四組進行，每組7支試管，分別考察對照品及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ部分萃取物浸膏對兩種細菌的MIC。

采用試管等倍稀釋法，先往每支滅菌試管中各加入1 mL無菌生理鹽水，在試管1中加入0.2 g/ mL的供試樣品溶液1 mL，混勻后從中取出1 mL加入試管2，依次類推，最后一個試管中棄去1 mL。至此，將原液制備成一系列不同濃度的稀釋液。再往每支試管中吸入19 mL培養(yǎng)基，充分混勻，趁熱倒入無菌培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，吸取200 μL上述濃度的菌懸液，接種在培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況。以完全無菌生長的最低濃度作為供試樣品溶液的MIC值。實驗中，同時以1 mL無菌生理鹽水代替竹葉提取物溶液與培養(yǎng)基混合作平板對照。

2.3 抗氧化活性試驗方法

采用亞硝基紅鹽-Co2+褪色法研究對·OH的清除作用［12］。H2O2/Co2+體系可類似Fenton反應產(chǎn)生·OH:Co2++H2O2=Co3++OH-+·OH，且產(chǎn)率較H2O2/Fe2+高得多。利用H2O2/Co2+體系產(chǎn)生·OH氧化亞硝基紅鹽-Co3+配合物，可使其在410 nm處的最大吸收峰減弱或消失。根據(jù)此原理建立了以A410變化反映·OH氧化作用的光度測量方法。

3 結果與討論

3.1 竹葉水提物及溶劑萃取物的得率

表1 竹葉水提物及各萃取物得率Table 1 Extraction rate of water extract and various fractions of bamboo leaves by extracting

3.2 竹葉水提物及溶劑萃取物的抑菌效果

以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，分別測定竹葉水提物和溶劑萃取物的抑菌效果，并與對羥基苯甲酸乙酯進行比較，所有樣品的溶劑作同步抑菌實驗對照。

由圖2和表2可知，各供試樣品對大腸桿菌的抑制作用稍強于金黃色葡萄球菌，石油醚部分和三氯甲烷部分萃取物對這兩種菌的抑菌作用比較顯著，與常用防腐劑對羥基苯甲酸乙酯差異較小;乙酸乙酯萃取物也有一定的抑菌效果，但不及前兩個部分。其中，石油醚萃取物具抑菌效果在竹葉相關研究中未見報道。各供試樣品所用的溶劑在相同實驗操作條件下均未體現(xiàn)抑菌作用或作用甚微。

表2 各溶劑的抑菌活性實驗結果Table 2 Result of antibacterial activity experiment on each solvent

圖2 竹葉水提物、各萃取物和對羥基苯甲酸乙酯的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activity of water extract and various fractions of bamboo leaves with ethylparaben as reference

可見，將竹葉水提物經(jīng)過萃取分離后，有效物分布得到相對集中，因此抑菌活性明顯增強，這為進一步探究竹葉中有效抑菌成分指明了方向。

3.3 竹葉萃取物的最低抑菌濃度(MIC)值

采用最低抑菌濃度(MIC)值法進一步考察提取物的抑菌活性，結果見表3所示。石油醚部分萃取物的MIC值為1.25 mg/mL，三氯甲烷部分萃取物的MIC值為2.50 mg/mL，乙酸乙酯部分萃取物的MIC值為5.00 mg/mL。三者最低抑菌濃度(MIC)值的結果比較與3.2中抑菌圈直徑實驗結果基本一致。其中，對照樣品對羥基苯甲酸乙酯的最低抑菌濃度(MIC)實驗值為1.25 mg/mL，與文獻報道值1000 ppm也基本一致。

表3 三部分提取物與對羥基苯甲酸乙酯的最低抑菌濃度值(MIC)的比較Table 3 Minimal inhibitory concentration(MIC)of the first three fractions from extract with ethylparaben as reference

3.4 竹葉提取物抗·OH自由基氧化試驗結果

按2.3的公式計算加入不同濃度提取物后對亞硝基紅鹽-Co2+體系產(chǎn)生的·OH自由基的清除率，如圖3所示。隨著提取物濃度的增加，對·OH自由基的清除效果也逐漸增強，表明提取物對自由基的抑制能力與濃度呈明顯的量效關系。試驗發(fā)現(xiàn)，有顯著抑菌活性的三氯甲烷及乙酸乙酯萃取物浸膏同時具有良好的抗氧化活性，各部分對·OH自由基的清除作用為:乙酸乙酯萃取物＞三氯甲烷萃取物＞水提物。其中，乙酸乙酯萃取物在體系中的IC50值為1.06 mg/mL，與對照品BHT近乎相當。

4 結論

本實驗采用水提取竹葉中有效成分，研究了竹葉水提取物以及不同溶劑萃取物的抑菌活性及抗氧化性，實驗發(fā)現(xiàn)，竹葉水提物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有一定的抑制作用，但抑菌效果不顯著，抑菌圈直徑僅為7.8 mm和8.6 mm。將水提液醇沉處理后，繼而經(jīng)不同極性的溶劑萃取，使有效抑菌成分得到集中，結果表明石油醚部分、三氯甲烷部分、乙酸乙酯部分均具有抑菌活性，且對大腸桿菌的抑制作用稍強于金黃色葡萄球菌。抑菌圈法(瓊脂擴散法)和最低抑菌濃度(MIC)法結果表明三部分提取物對兩種供試菌的抑菌圈直徑達9.8～18.4 mm，最低抑菌濃度分別為1.25 mg/mL，2.50 mg/mL和5.00 mg/mL，其中石油醚部分具抑菌效果在竹葉相關研究中未見報道。了解活性成分在植物中的極性分布范圍，對天然植物有效成分的提取具有指導性的意義。

圖3 不同濃度竹葉提取物對·OH自由基的清除作用的影響Fig.3 The effect of the concentration of bamboo leaves extract on·OH free radicals scavenging activity

通過亞硝基紅鹽-Co2+褪色法研究對·OH自由基的清除率，結果表明竹葉水提物的三氯甲烷及乙酸乙酯萃取物浸膏同時具有良好的抗氧化活性，且各部分對·OH自由基的清除作用為:乙酸乙酯萃取物＞三氯甲烷萃取物＞水提物。其中，乙酸乙酯萃取物在體系中的IC50值為1.06 mg/mL。

竹葉提取物不僅具有明顯的抗菌作用，同時也具有抗氧化作用，因此，竹葉提取物是一種有開發(fā)價值的天然防腐劑和天然抗氧化劑。

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In vitro Antibacterial and Antioxidant Activity of Bamboo Leaves Extract

NI Xiang-mei，CAO Guang-qun*
Schoo1 of Chemica1 and Materia1 Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China

The bamboo leaves extract was obtained by decocting with water and then deposited with ethanol to remove the sample matrix.Water extract was further extracted by four different polarity solvents i.e.petroleum ether，chloroform，ethyl acetate and n-butanol，successively.Antibacterial activity on Staphylococcus aureus and Escherichia coli of the four fractions were studied by inhibition zone method(agar diffusion method)and minimal inhibitory concentration method (MIC)comparing with ethylparaben.The results indicated that the petroleum ether，chloroform，and ethyl acetate fractions exhibited significant inhibitory effects on both kinds of bacteria.The inhibition zones of samples for test were between 9.8 and 18.4 mm and minimal inhibitory concentration(MIC)were 1.25 mg/mL，2.50 mg/mL，and 5.00 mg/ mL，respectively.Finally the scavenging effect on·OH radical of bamboo leaves extract was studied by Nit-R-Co2+system，it was found that the chloroform and ethyl acetate fractions also possessed significant antioxidant activity，and IC50of ethyl acetate extract was 1.06 mg/mL.

bamboo leaves extract;antibacterial activity;antioxidant activity;free radicals scavenging

1001-6880(2011)04-0717-05

2010-07-21 接受日期:2010-11-17

*通訊作者 Tel:86-013706182565;Email:gqcao@jiangnan.edu.cn

R284.2;Q946.91

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