黃玲 高峻 蔣斐 路箏 滿曉華 許愛芳 李兆申

·論著·

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ在大鼠慢性胰腺炎進(jìn)程中的表達(dá)及意義

黃玲 高峻 蔣斐 路箏 滿曉華 許愛芳 李兆申

目的探討過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)在大鼠慢性胰腺炎(CP)進(jìn)程中的表達(dá)及其意義。方法經(jīng)大鼠尾靜脈一次性注射二丁基二氯基錫方法制備CP模型。按體重隨機(jī)分為對(duì)照組及造模后1、3、5、7、14、42 d組。行胰腺常規(guī)病理檢查，Sirius Red染色觀察膠原含量，測(cè)定胰腺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性，免疫組化法測(cè)定α-SMA、PPAR-γ蛋白的表達(dá)。結(jié)果造模7 d內(nèi)胰腺呈急性炎癥改變，42 d時(shí)出現(xiàn)不同程度的腺泡壞死、萎縮，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉內(nèi)或小葉周圍纖維化形成，伴胰管改變，符合從急性胰腺炎(AP)向CP的進(jìn)展過(guò)程。造模后1 d，胰腺組織MPO活性、α-SMA蛋白表達(dá)即顯著增加[(0.78±0.71)U/g比(0.15±0.05)U/g，6.67±3.14比0，P值均<0.05]，之后隨造模時(shí)間延長(zhǎng)未繼續(xù)增加。造模后7 d，膠原含量達(dá)峰值，為(45.42±15.99)%，較對(duì)照組的(10.87±2.28)%顯著增加(P<0.05),膠原沉積從僅在血管壁進(jìn)展到沉積在導(dǎo)管周圍至小葉內(nèi)和(或)小葉周圍。對(duì)照組PPAR-γ僅在血管壁呈陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)量為0.17±0.41，隨造模時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)漸增強(qiáng)，42 d達(dá)峰值，為4.83±2.71。結(jié)論在CP造模過(guò)程中PPAR-γ蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，并發(fā)揮有限的抗炎癥和抗纖維化作用。

胰腺炎，慢性； 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ； 星形細(xì)胞

慢性胰腺炎(CP)是一種多因素共同參與的炎癥過(guò)程，其特征是胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells，PSCs)被激活，合成并釋放大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，引起胰腺組織進(jìn)行性纖維化，導(dǎo)致胰腺內(nèi)外分泌功能受損。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)參與PSCs的活化和功能調(diào)節(jié)。本研究動(dòng)態(tài)觀察大鼠從急性胰腺炎(AP)進(jìn)展為CP過(guò)程中PPAR-γ的表達(dá)變化，探討其意義。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

42只清潔級(jí)雄性Wistar大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，6～8周齡，體重(200±20)g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005。自由飼養(yǎng)1周后稱重，按體重隨機(jī)法分為對(duì)照組及造模后 1、3、5、7、14、42 d組。參考文獻(xiàn)[1,2]方法，采用尾靜脈一次性注射二丁基二氯基錫(di-n-butyltin dichloride，DBTC)8 mg·ml-1·kg-1體重的方法建立大鼠CP模型。對(duì)照組尾靜脈注射100%乙醇和甘油配制成的有機(jī)溶劑1 ml/kg體重。造模后1、3、5、7、14、42 d分批處死大鼠。取胰腺組織，部分置10%甲醛溶液固定，部分置-80℃保存。

二、方法

1．胰腺組織病理檢查及膠原纖維染色：取固定的胰腺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，普通光鏡下觀察組織學(xué)變化，并參考Merkord等[3]方法從異常結(jié)構(gòu)、腺泡萎縮、纖維化、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等4方面行組織病理評(píng)分；另取切片行Sirius Red染色，每張切片隨機(jī)觀察3個(gè)高倍視野，應(yīng)用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)測(cè)定Sirius Red陽(yáng)性染色面積(%)[4]。

2．胰腺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性測(cè)定：應(yīng)用MPO試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測(cè)MPO活性，按說(shuō)明書操作。MPO活性表示中性粒細(xì)胞的數(shù)目。

3．胰腺組織α-SMA、PPAR-γ蛋白表達(dá)的檢測(cè)：采用Envision免疫組化方法檢測(cè)?？功?SMA和PPAR-γ一抗1∶100稀釋。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。以胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒為陽(yáng)性染色。高倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度。陽(yáng)性細(xì)胞0、<10%、10%～50%、>50%分別計(jì)0～3分；染色程度為淺黃色、黃褐色、深褐色分別計(jì)1～3分。兩分乘積為免疫組化陽(yáng)性指數(shù)(positive index, PI)[5]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、大鼠CP模型的建立

對(duì)照組大鼠胰腺大體和組織學(xué)未見改變(圖1上a)，血管壁膠原沉積(圖1上b)。造模后7 d內(nèi)大鼠胰腺充血、水腫明顯，組織學(xué)呈AP病理改變，伴導(dǎo)管周圍出現(xiàn)膠原沉積。隨時(shí)間延長(zhǎng)，胰腺組織血供減少，呈黃色、薄平狀，主胰管輕度至重度擴(kuò)張。造模14 d后可見胰周滲出、粘連，部分大鼠可見膽管重度擴(kuò)張、肝臟腫大、膽汁淤積等改變，膠原沉積在導(dǎo)管周圍至小葉內(nèi)和(或)小葉周圍(圖下a)。42 d時(shí)出現(xiàn)不同程度的腺泡壞死、萎縮，淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉內(nèi)或小葉周圍纖維化形成，伴胰管改變(圖下b)。各組胰腺病理學(xué)評(píng)分見表1，對(duì)照組及造模后1、3、5、7、14、42 d組的膠原含量分別為(10.87±2.28)%、(13.72±6.96)%、(22.42±8.40)%、(33.51±20.84)%、(45.42±15.99)%、(37.46±18.91)%、(34.72±11.69)%。胰腺病理改變符合從AP進(jìn)展到CP的過(guò)程，表明造模成功。

二、胰腺組織MPO活性變化

對(duì)照組及造模后1、3、5、7、14、42 d組的胰腺組織MPO活性分別為(0.15±0.05)、(0.78±0.71)、(0.38±0.1)、(0.44±0.17)、(0.36±0.1)、(0.33±0.15)、(0.45±0.15)U/g。造模各組胰腺的MPO活性均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)。

三、胰腺組織α-SMA蛋白表達(dá)的變化

對(duì)照組α-SMA僅在胰腺內(nèi)血管壁表達(dá)(圖1上c)；造模后α-SMA最初位于血管壁、導(dǎo)管壁，漸累及小葉內(nèi)和(或)小葉間區(qū)域(圖1下c)。對(duì)照組及造模后1、3、5、7、14、42 d組α-SMA表達(dá)的PI分別為0、6.67±3.14、5.00±2.68、5.50±1.97、6.67±3.14、5.67±2.88、5.67±2.88。造模各組的α-SMA表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)

四、胰腺組織PPAR-γ蛋白表達(dá)的變化

對(duì)照組PPAR-γ僅在胰腺內(nèi)血管壁陽(yáng)性表達(dá)(圖1上d)；造模后3 d，PPAR-γ在腺泡、導(dǎo)管和(或)胰島細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)漸增強(qiáng)，42 d表達(dá)最強(qiáng)(圖1下d)。對(duì)照組及造模后1、3、5、7、14、42 d組胰腺PPAR-γ表達(dá)的PI分別為0.17±0.41、0.17±0.41、2.17±1.60、2.33±1.37、3.00±2.00、3.17±1.83、4.83±2.71。造模3 d后，胰腺PPAR-γ表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)。

討 論

PPAR-γ屬核激素受體家族的成員，它通過(guò)與配體結(jié)合方式來(lái)激活轉(zhuǎn)錄因子，其內(nèi)源性配體包括脂肪酸、花生四烯酸代謝產(chǎn)物和前列腺素，人工合成配體包括非類固醇抗炎藥物以及抗糖尿病藥物噻唑烷二酮類家族的成員，如曲格列酮等。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠失血性休克模型，內(nèi)源性配體釋放激活的PPAR-γ，可避免失血性休克所致的肝臟損傷[6]。Nakajima等[7]在小鼠腸道缺血-再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)，腸道組織存在內(nèi)源性PPAR-γ途徑，內(nèi)源性配體激活PPAR-γ為腸道缺血-再灌注損傷提供保護(hù)作用，包括直接受累的組織和遠(yuǎn)處臟器。同時(shí)，PPAR-γ配體在許多炎癥模型中發(fā)揮抗炎作用，如肺炎[8]、心肌再灌注損傷[9]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[10]、膿毒癥[11]、帕金森病[12]、阿爾茨海默病[13]和動(dòng)脈粥樣硬化癥[14]等。

圖1對(duì)照組(上)和CP組(下)胰腺病理改變(a)、膠原纖維沉積(b)及α-SMA(c)、PPAR-γ(d)表達(dá)(HE，SiriusRed染色，免疫組化 ×200)

表1 各組大鼠胰腺組織病理評(píng)分

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05

目前，一些研究揭示了PPAR-γ與PSCs的關(guān)系。Masamune等[15]報(bào)道，PPAR-γ配體15 d-PGJ2或曲格列酮能夠抑制PSCs的激活，降低α-SMA、前膠原α和脯氨酰羥化酶mRNA的水平，具有抗纖維化和抗炎癥作用。Shimizu等[16]報(bào)道，PPAR-γ激動(dòng)劑曲格列酮以劑量依賴性方式增加PSCs的吞噬活性和CD36的表達(dá)；阻斷CD36能夠減弱曲格列酮所誘導(dǎo)的吞噬作用；沉默PPAR-γ基因，吞噬作用和CD36的表達(dá)減弱。Mews等[17]報(bào)道，在大鼠AP形成過(guò)程中，胰腺組織TNF-α和IL-10等因子釋放增多，它們能夠激活PSCs；當(dāng)AP反復(fù)發(fā)作，這些細(xì)胞因子使PSCs始終處于激活狀態(tài)，膠原合成漸增，最終導(dǎo)致胰腺纖維化形成。本研究顯示，造模后7 d內(nèi)胰腺出現(xiàn)AP的組織學(xué)改變，α-SMA表達(dá)及膠原含量顯著增加，并達(dá)到峰值，反映了AP過(guò)程釋放的一些炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子能夠激活PSCs，大量合成細(xì)胞外基質(zhì)。胰腺組織MPO活性在造模后1 d達(dá)峰值，提示在急性炎癥反應(yīng)中以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主。此時(shí)PPAR-γ蛋白呈低水平表達(dá)。隨著炎癥持續(xù)存在，α-SMA表達(dá)及膠原含量沒有進(jìn)一步的增加，而PPAR-γ表達(dá)逐漸增強(qiáng)，42 d時(shí)達(dá)峰值。提示在胰腺纖維化病變形成過(guò)程中，PPAR-γ可能抑制PSCs的激活，抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮有限的抗炎癥和抗纖維化作用。

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2011-05-08)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionsofPPARγproteinduringthecourseofpancreaticfibrosisofchronicpancreatitisinWistarrats

HUANGLing,GAOJun,JIANGFei,LUZheng,MANXiao-hua,XUAi-fang,LIZhao-shen.

DigestiveDiseaseDiagnosisandTreatmentCenter,SongjiangHospital,FirstPeople′sHospitalofShanghai,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai201600,China

LIZhao-shen,Email:lizhaoshen111@gmail.com

ObjectiveTo observe the expressions of PPAR-γ protein during the course of pancreatic fibrosis of chronic pancreatitis(CP) in Wistar rats and its significance.MethodsBibutyltin dichloride (DBTC, 8 mg/kg body weight) in a volume of 200 ml solvent was injected into the tail vein to establish the CP rat's model. Wistar rats were randomly divided into control group and 1, 3, 5, 7, 14, 42 d group according to weights. Pancreatic tissue underwent routine pathological examination, and collagen accumulation in pancreatic sections was determined by staining for Sirius Red. Pancreatic myeloperoxidase (MPO) activity was determined. Expressions of α-SMA and PPAR-γ proteins were assessed by immunohistochemical method.ResultsLight microscopy showed signs of acute pancreatitis with interstitial edema and infiltration of neutrophilic granulocytes 7 d after DBTC injection. Acinar cells necrosis, atrophy, lymphocytes and monocytes infiltration, fibrosis within lobule and peri-lobule as well as pancreatic duct changes were found, which was in accord with the course from AP to CP. One days after induction, the activity of MPO, expressions of α-SMA was significantly increased[(0.78±0.71)vs(0.15±0.05)U/g, 6.67±3.14vs0,P<0.05], then it did not increase with time of induction. Seven days after induction, collagen level reached the peak [(45.42±15.99)%], which was significantly higher than that in control group [(10.87±2.28)%,P<0.05]. Collagen fibers accumulated from periductal to intra-acinar and/or inter-acinar areas. In control rats, the expression of PPAR-γ protein was positive only in vessel walls, and the expression level was 0.17±0.41 and increased with time of induction, then reached the peak of 4.83±2.71 at 42 d.ConclusionsDuring the course of pancreatic fibrosis in rats, the expression of PPAR-γ protein is gradually increased, and plays a limited anti-inflammation and anti-fibrosis role.

Pancreatitis, chronic; Peroxisome proliferator-activated receptor-γ; Astrocytes

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.015

201600 上海，上海交通大學(xué)第一人民醫(yī)院松江分院消化疾病診治中心(黃玲)；第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科(高峻、蔣斐、路箏、滿曉華、許愛芳、李兆申)

李兆申，Email:lizhaoshen111@gmail.com