任艷 高軍 王小瑋 劉建強(qiáng) 顧俊駿 金晶 龔燕芳 李兆申

·論著·

糞便Alu序列的檢測(cè)在胰腺癌診斷中的價(jià)值

任艷 高軍 王小瑋 劉建強(qiáng) 顧俊駿 金晶 龔燕芳 李兆申

目的檢測(cè)胰腺癌患者糞便Alu序列表達(dá)量，探討其對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值。方法收集41例胰腺癌、27例慢性胰腺炎及23例健康者的糞便樣本，采用酚-氯仿方法抽提糞便中基因組DNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)Alu重復(fù)序列的表達(dá)量。結(jié)果胰腺癌、慢性胰腺炎、正常健康者糞便Alu重復(fù)序列表達(dá)量分別為(5.17±0.99)、(3.79±0.94)、(0.28±0.35)ng/g，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。通過(guò)接受者操作特征(ROC)曲線分析，胰腺癌的曲線下面積為74.8%，95%可信度為0.661～0.835，診斷胰腺癌的敏感性為75.6%，特異性為67.1%。結(jié)論胰腺癌患者糞便Alu序列表達(dá)量顯著增加，對(duì)胰腺癌的診斷可能有一定價(jià)值。

胰腺腫瘤； Alu序列； 診斷； 實(shí)時(shí)定量PCR； 糞便

Alu重復(fù)序列是人類(lèi)基因組中一族散布的、長(zhǎng)度大約為300 bp的中等重復(fù)序列。它是短分散重復(fù)序列(short interspersed elements，SINEs，≤500 bp)中最大的一個(gè)家族，約占基因組的5%～10%，以平均間隔4 kb隨機(jī)分散于整個(gè)基因組中。Alu序列插入到功能重要的基因區(qū)或其他Alu依賴(lài)性的基因功能改變區(qū)會(huì)導(dǎo)致多種遺傳性疾病，并且可能和腫瘤的發(fā)生相關(guān)[1]。本研究旨在觀察Alu序列表達(dá)與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，探討其臨床意義。

材料與方法

一、研究對(duì)象

選取長(zhǎng)海醫(yī)院2007年9月至2010年5月住院患者68例，其中胰腺癌患者41例，慢性胰腺炎患者27例。以正常健康者23例作為對(duì)照?；颊叩囊话闱闆r見(jiàn)表1。

表1 各組的一般臨床資料

二、糞便收集方法及DNA提取

標(biāo)本收集于凍存管后即置于冰盒中，在6 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。從凍存管中稱(chēng)取200 mg糞便，先加入淀粉及TEN預(yù)處理，采用酚-氯仿方法抽提DNA，再采用qiagen純化試劑盒純化DNA。使用NanoDrop (ND-1000, USA) 進(jìn)行DNA濃度檢測(cè)和純度鑒定，置-80℃保存。

三、實(shí)時(shí)PCR

Alu序列包括保守區(qū)域及可變區(qū)域，設(shè)計(jì)的PCR引物應(yīng)完全或部分位于保守區(qū)域(至少是3′端引物，圖1)。Alu上游引物：5′-ACGCCTGTAATCCCAGCACTT-3′；下游引物：5′-TCGCCCAGGCTGGAGTGCA-3′,擴(kuò)增片段245 bp。糞便DNA以1∶5的比例稀釋?zhuān)? μl加入包含SYBR GREEN Supermix的25 μl反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min，95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s，25個(gè)循環(huán)。選取30例正常糞便DNA進(jìn)行混合，作為參照。

陽(yáng)性標(biāo)本的PCR擴(kuò)增曲線呈典型的S型曲線，陰性對(duì)照是一條不規(guī)則的波浪線。Ct為循環(huán)閾值，△Ct=Ct樣品- Ct內(nèi)參，△△Ct=△Ct-(Ct陰性樣品-Ct陰性?xún)?nèi)參)，樣品中目的基因初始cDNA相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct表示。

圖1 PCR引物設(shè)計(jì)圖

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)DNA樣本以10倍體積倍比稀釋?zhuān)珼NA量分別為2.5 ng，250 pg，25 pg，2.5 pg，250 fg，25 fg。標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的PCR擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2a，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2b。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的PCR擴(kuò)增曲線(a)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(b)

二、糞便Alu序列的表達(dá)

糞便Alu的擴(kuò)增曲線及溶解曲線見(jiàn)圖3。溶解曲線只有單峰，可排除非特異性擴(kuò)增。胰腺癌患者Alu序列表達(dá)量為(5.17±0.99)ng/g,慢性胰腺炎、正常對(duì)照者的表達(dá)量分別為(3.79±0.94)、(0.28±0.35)ng/g，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。通過(guò)接受者操作特征(ROC)曲線分析，胰腺癌、慢性胰腺炎和正常對(duì)照人群之間有顯著差異，胰腺癌的曲線下面積(AUC)為74.8%，95%可信度為0.661～0.835，診斷胰腺癌的敏感性為75.6%，特異性為67.1%。

圖3 糞便樣品的PCR擴(kuò)增曲線(a)及溶解曲線(b)

Alu序列在人類(lèi)基因組中普遍存在，但未見(jiàn)于其他非靈長(zhǎng)類(lèi)物種[2]。目前的研究表明，Alu序列與某些惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Rohlfs等[3]用Southern雜交等方法對(duì)兩個(gè)乳腺癌及卵巢癌家族進(jìn)行研究，結(jié)果顯示Alu介導(dǎo)的同源重組可導(dǎo)致BRCAl基因外顯子8、9間出現(xiàn)5 kb的缺失，認(rèn)為這種缺失和復(fù)制是導(dǎo)致家族性乳腺癌和卵巢癌的重要因素。Tournier等[4]報(bào)道，Alu介導(dǎo)的同源重組可導(dǎo)致BRCA2基因外顯子8與外顯子9的缺失。Ichimura等[5]采用相同的方法對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)行研究，結(jié)果顯示Alu介導(dǎo)的同源重組可導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤特異性基因p107的缺失。Wang等[6]檢測(cè)108例遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(HNPCC)的MLHl、MSH2、MSH6等錯(cuò)配修復(fù)基因的突變，結(jié)果顯示38%的患者存在MLHl和MSH2的點(diǎn)突變，19例患者出現(xiàn)基因缺失，其中42%發(fā)生在MLHl，58%發(fā)生在MSH2，而這些基因突變都是由Alu介導(dǎo)的同源重組所導(dǎo)致的。Hsieh等[7]在Hep3B肝癌細(xì)胞株中分離出了一個(gè)異常的CAD基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它的外顯子3被截短的轉(zhuǎn)座Alu序列所代替，從而認(rèn)為肝癌的發(fā)生與Alu介導(dǎo)的基因突變有關(guān)。Strout等[8]報(bào)道，急性髓樣白血病(AML)的發(fā)生與染色體導(dǎo)致的基因融合有關(guān)，而部分串聯(lián)重復(fù)又是其中重要的機(jī)制，通過(guò)對(duì)9例AML患者的基因融合的DNA序列進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)部分串聯(lián)重復(fù)總是由Alu介導(dǎo)的同源重組產(chǎn)生。

然而，最近的兩個(gè)多中心的實(shí)驗(yàn)研究表明，有關(guān)糞便Alu表達(dá)的研究非常少，源于糞便標(biāo)本的收集及儲(chǔ)存可能導(dǎo)致樣本降解，并且抽提方法仍不成熟。本研究采用qiagen試劑盒提供的抽提方法并予以改良，結(jié)果表明DNA抽提結(jié)果穩(wěn)定。這一無(wú)創(chuàng)性檢查方法具有標(biāo)本易采取、操作簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)，為下一步實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。我們采用實(shí)時(shí)定量PCR方法的檢測(cè)范圍從250 fg到2.5 ng范圍。本結(jié)果顯示，胰腺癌患者糞便中Alu序列表達(dá)量顯著高于慢性胰腺炎及正常對(duì)照者，提示檢測(cè)胰腺癌Alu序列的表達(dá)量對(duì)胰腺癌的診斷可能有一定的價(jià)值。

[1] Schmid CW. Alu: structure, origin, evolution, significance and function of one-tenth of human DNA. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1996,53:283-319.

[2] Shih C,Weinberg RA. Isolation of a transforming sequence from a human bladder carcinoma cell line. Cell, 1982,29:161-169.

[3] Rohlfs EM,Puget N,Graham ML,et al. An Alu-mediated 7.1 kb deletion of BRCA1 exons 8 and 9 in breast and ovarian cancer families that results in alternative splicing of exon 10. Genes Chromosomes Cancer, 2000,28:300-307.

[4] Tournier I, Paillerets BB,Sobol H,et al.Significant contribution of germline BRCA2 rearrangements in male breast cancer families. Cancer Res,2004,64:8143-8147.

[5] Ichimura K, Hanafusa H,Takimoto H,et al.Structure of the human retinoblastoma-related p107 gene and its intragenic deletion in a B-cell lymphoma cell line. Gene,2000,251:37-43.

[6] Wang Y,Friedl W,Lamberti C, et al.Hereditary nonpolyposis colorectal cancer: frequent occurrence of large genomic deletions in MSH2 and MLH1 genes. Int J Cancer,2003,103:636-641.

[7] Hsieh SY,Liaw SF,Lee SN, et al.Aberrant caspase-activated DNase (CAD) transcripts in human hepatoma cells. Br J Cancer, 2003,88:210-216.

[8] Strout MP,Marcucci G,Bloomfield CD,et al.The partial tandem duplication of ALL1 (MLL) is consistently generated by Alu-mediated homologous recombination in acute myeloid leukemia. Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:2390-2395.

2011-01-14)

(本文編輯：屠振興)

ValueofdetectionoffecalAlurepetitivesequencesinthediagnosisofpancreaticcancer

RENYan,GAOJun,WANGXiao-wei,LIUJian-qiang,GUJun-jun,JINJing,GONGYan-fang,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:lizhaoshen111@gmail.com

ObjectiveTo detect the Alu expression in the stool of patients with pancreatic cancer and investigate its value in the diagnosis of pancreatic cancer.MethodsStool samples were obtained from patients with pancreatic cancer (PC) (n=41), chronic pancreatitis (CP) (n=27) and healthy subjects (n=23), the DNA was extracted from the stool and the expression of Alu repetitive sequences was subjected to quantitative analysis by the real-time PCR.ResultsThe expressions of Alu repetitive sequences in PC, CP, and healthy subjects were (5.17±0.99), (3.79±0.94), (0.28±0.35) ng/g, and the difference among the three groups was statistically significant (P<0.05). The AUC of PC was 74.8% with the 95%CI0.661～0.835, and the sensitivity, specificity was 75.6% and 67.1%, respectively.ConclusionsAlu repetitive sequences are highly expressed in the stool of patients with pancreatic cancer, and it is of value in the diagnosis of pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; Alu repeats; Diagnosis; Real-time PCR; Feces

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.001

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2006BAI02A12)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申，Email：lizhaoshen111@gmail.com