孫楹 楊淑麗 葉建新 祝建紅 陳衛(wèi)昌

·短篇論著·

α-硫辛酸對(duì)急性壞死性胰腺炎合并肺損傷的保護(hù)作用

孫楹 楊淑麗 葉建新 祝建紅 陳衛(wèi)昌

重癥急性胰腺炎(SAP)并發(fā)肺損傷的病理機(jī)制尚未完全闡明。目前研究認(rèn)為核因子κB(NF-κB)在SAP發(fā)病過程中扮演重要角色[1]。α-硫辛酸(α-lipoic acid, ALA)屬于維生素B的一類化合物，是已知抗氧化劑中作用比較廣泛的一種，具有抑制NF-κB的作用，在改善人的體質(zhì)、抗氧化，治療糖尿病并發(fā)癥和其他多種疾病方面?zhèn)涫荜P(guān)注[2]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ALA干預(yù)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，觀察其對(duì)ANP并發(fā)肺損傷的保護(hù)作用，探討其可能的作用機(jī)制。

一、材料和方法

1．材料：健康Sprague-Dawley(SD)大鼠54只，清潔級(jí)，體重200～250 g，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。?；悄懰徕c(95% )、α-硫辛酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TNF-α、ICAM-1試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司，髓過氧化物酶(myelopercxidase，MPO)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，兔抗鼠NF-κB p65多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司。

2．實(shí)驗(yàn)分組及模型制備：54只SD大鼠按完全隨機(jī)法分為對(duì)照組、ANP組和ALA組，各18只。參照Aho等[3]的方法，采用胰膽管逆行注入5%?；悄懰徕c(0.1 ml/l00 g體重，0.1 ml/min)制備ANP大鼠模型。ALA組在ANP造模前1 h腹腔內(nèi)注射ALA(0.1 g/kg體重)。對(duì)照組開腹后僅翻動(dòng)胰腺即關(guān)腹。術(shù)后3、6、12 h分批經(jīng)左心室抽血，離心分離血清。將大鼠處死，分別取肺、胰腺組織，部分用10%甲醛固定，部分液氮保存。

3．觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法：固定的肺、胰腺組織經(jīng)石蠟包埋、切片，光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。應(yīng)用常規(guī)免疫組化法檢測(cè)肺組織NF-κB表達(dá)。每組選取5張切片，每張切片選取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。采用ELISA方法檢測(cè)血清TNF-α、ICAM-1水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。檢測(cè)肺組織勻漿的MPO，按照試劑盒說明書操作。

二、結(jié)果

1．胰腺、肺組織病理改變：對(duì)照組大鼠胰腺及肺組織無明顯變化 (圖1a)。ANP組大鼠胰腺出血壞死，腹腔內(nèi)有大量血性或黃色混濁腹水，大網(wǎng)膜及膽總管處見皂化斑(圖1b)。

鏡下見ANP組胰腺腺泡水腫，腺泡結(jié)構(gòu)消失，葉間隔、小葉間隔及腺泡間隔顯著增寬，間質(zhì)內(nèi)大量紅細(xì)胞滲出和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡細(xì)胞呈不同程度變性、壞死，胰周出血，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)行性加重(圖2上b)；肺組織肺泡及肺間質(zhì)水腫，間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞滲出，隨時(shí)間延長(zhǎng)，肺泡壁破裂，肺泡塌陷實(shí)變(圖2上c)。ALA組胰腺、肺組織病理變化同ANP組，但炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出減輕(圖2下b、c)。

圖1 對(duì)照組(a)和ANP組(b)胰腺的大體標(biāo)本

圖2對(duì)照組(a)、ANP 組(b)、ALA組(c)大鼠胰腺(上)和肺組織(下)病理變化(HE ×100)

2．肺組織NF-κB表達(dá)：細(xì)胞胞質(zhì)及胞核內(nèi)出現(xiàn)均勻棕黃色細(xì)顆粒狀為陽性表達(dá)。對(duì)照組肺組織僅有極少量肺泡間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)NF-κB(圖3a)。ANP組肺組織NF-κB表達(dá)均較對(duì)照組明顯增加，6 h達(dá)高峰，12 h仍保持較高水平。陽性染色主要位于支氣管黏膜上皮細(xì)胞(圖3b)。ALA組陽性細(xì)胞數(shù)低于ANP組 (圖3c，表1)。

圖3對(duì)照組(a)、ANP 組(b)、ALA組(c)大鼠肺組織NF-κB表達(dá)(免疫組化 ×200)

3．血TNF-α、ICAM-1水平：ANP組血TNF-α、ICAM-1水平均較對(duì)照組明顯增高；ALA組血TNF-α、ICAM-1水平較ANP組顯著降低(表1)。血清TNF-α、ICAM-1水平與NF-κB表達(dá)密切相關(guān)(r分別為0.629、0.834，P<0.05)。

4．肺組織MPO水平：ANP組6、12 h肺組織MPO水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，但3 h時(shí)MPO水平與對(duì)照組無顯著性差異(P=0.07)，ALA組3、6、12 h肺組織MPO水平均較ANP組明顯降低(P<0.05，表1)。

表1 血清TNF-α、ICAM-1及肺組織MPO、NF-κB的變化

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

討論研究發(fā)現(xiàn),SAP時(shí)胰腺及肺組織內(nèi)NF-κB激活并伴有過度活化的炎癥細(xì)胞，后者可釋放多種炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1、IL-6、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、氧自由基(ROS)、血小板活化因子(PAF)及P-、E-選擇素等。NF-κB被激活后，進(jìn)入細(xì)胞核與DNA特定的κB序列結(jié)合，使上述炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，通過細(xì)胞外正反饋途徑導(dǎo)致炎癥信號(hào)進(jìn)一步放大，引起細(xì)胞因子“瀑布樣”級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使得炎癥不斷擴(kuò)散，胰腺及肺組織損傷加重[4]。本結(jié)果顯示，ANP大鼠發(fā)病早期即觀察到NF-κB的明顯激活，發(fā)病6 h達(dá)峰值，與Gukovsky等[5]報(bào)道的結(jié)果一致。

MPO存在于中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中，通過測(cè)定MPO的活力可推算中性粒細(xì)胞的數(shù)量，因此肺組織MPO活性常用來反映肺組織損傷的指標(biāo)[6]。 本結(jié)果顯示，ANP組大鼠肺組織MPO活性在造模后6 h明顯增高，其后維持在高水平，提示ANP 6 h后中性粒細(xì)胞在肺組織聚集，引起肺組織損傷。

ALA是一種強(qiáng)抗氧化劑，能夠阻斷NF-κB的激活[7]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ALA干預(yù)ANP大鼠，結(jié)果明顯降低大鼠胰腺及肺組織的損傷程度，紅細(xì)胞滲出及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，且肺組織NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，MPO水平亦明顯下降。同時(shí)，血TNF-α、ICAM-1水平明顯下降，且與NF-κB的活性呈正相關(guān)，提示ALA能阻斷NF-κB的激活，減少炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，從而發(fā)揮對(duì)胰腺及肺損傷的保護(hù)作用，有望成為治療急性胰腺炎肺損傷的新靶點(diǎn)。

[1] 張喜平, 陸貝.核因子-κB在重癥急性胰腺炎發(fā)病過程及MODS中的作用.醫(yī)學(xué)研究雜志,2006,35:83-85.

[2] Sung MJ,Kim W,Anh SY,et al.Protective effect of alpha-lipoic acid in lipopolysaccharide-induced endothelial fractalkine expression.Circ Res,2005,97:880-890.

[3] Aho HJ, Koskensalo SM, Nevalainen TJ. Experimental pancreatitis in the rat. Sodium taurocholate-induced acute haemorrhagic pancreatitis. Scand J Gastroenterol, 1980,15:411-416.

[4] 孫備,白雪巍,孟慶輝,等.核轉(zhuǎn)錄因子抑制劑對(duì)重癥急性胰腺炎的影響.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2006,23:179-181.

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[6] Li YQ,Zhang ZX,Xu YJ,et al.N-Acetyl-L-cysteine and pyrrolidine dithiocar-bamate inhibited nuclear factor-kappaB activation in alveolar macrophages by different mechanisms.Acta Pharmacol Sin,2006,27:339-346.

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2010-12-08)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.019

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