周?chē)?guó)雄 朱陳 丁曉凌 張海峰 張弘 曹維 強(qiáng)暉 徐正府

·論著·

MK886和Celecoxib抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞生長(zhǎng)及血管生成的實(shí)驗(yàn)研究

周?chē)?guó)雄 朱陳 丁曉凌 張海峰 張弘 曹維 強(qiáng)暉 徐正府

目的觀(guān)察5-脂氧合酶拮抗劑MK886、環(huán)氧化酶2拮抗劑Celecoxib干預(yù)SW1990細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)mRNA表達(dá)的影響。方法應(yīng)用不同濃度的MK886、Celecoxib以及兩者聯(lián)合處理SW1990細(xì)胞，采用膽囊收縮素(CCK-8)法檢測(cè)細(xì)胞的增殖， RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞白三烯B4受體1 (BLT1)mRNA、前列腺素2(PGE2) mRNA、VEGF mRNA的表達(dá)。結(jié)果10 μmol/L MK886或20 mmol/L Celecoxib處理24 h后，SW1990細(xì)胞的增殖受到明顯抑制(1.80±0.06比1.65±0.10；2.04±0.03比1.86±0.02，P<0.05)，且隨藥物濃度的增加，細(xì)胞的增殖抑制更明顯。兩拮抗劑聯(lián)合干預(yù)12 h后，SW1990細(xì)胞的增殖即受到非常明顯的抑制(1.72±0.05比1.52±0.05，P<0.01)。Celecoxib處理細(xì)胞48 h后，細(xì)胞BLT1、VEGF mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化，但PGE2 mRNA的表達(dá)明顯減少(37.50比71.50，P<0.05)；MK886或MK886+Celecoxib聯(lián)合處理細(xì)胞后，細(xì)胞BLT1、VEGF mRNA表達(dá)明顯減少(40.30、22.75比126.50，P<0.05)，而PGE2 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化。結(jié)論花生四烯酸的兩條代謝途徑均與胰腺癌的發(fā)生及增殖有密切關(guān)系，同時(shí)抑制兩條途徑可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。

胰腺腫瘤； MK886； Celecoxib； 5-脂氧合酶； 環(huán)氧化酶-2

研究顯示，花生四烯酸代謝途徑與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系?；ㄉ南┧岬拇x有兩條途徑，即環(huán)氧化酶(COX)和脂氧合酶(LOX)代謝途徑。COX代謝途徑的下游產(chǎn)物是前列腺素2(prostaglandin E2,PGE2)，LOX催化的代謝終產(chǎn)物為白三烯(leukotrienes, LTs)。Celecoxib是COX2拮抗劑，MK886是特異性5-LOX拮抗劑。5-LOX還可影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，促進(jìn)腫瘤血管生成。本研究應(yīng)用MK886和Celecoxib干預(yù)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990，觀(guān)察其對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)及VEGF mRNA表達(dá)的影響，探討抑制胰腺癌細(xì)胞增殖更有效的途徑。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

胰腺癌細(xì)胞株SW1990購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所，用含10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)， 3～4 d用胰酶消化，按1∶3傳代。

二、細(xì)胞增殖檢測(cè)

采用膽囊收縮素(CCK-8)法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×104個(gè)細(xì)胞(100 μl)接種于96孔板培養(yǎng)過(guò)夜。加入終濃度為10、20、40、80、100、200 μmol/L的MK886(Bimol公司)或10、20、40、80、100 μmol/L的Celecoxib(上海信合化工有限公司)或200 μmol/L MK886+80 μmol/L Celecoxib繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48 h。每個(gè)劑量組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加含0.01% DMSO培養(yǎng)液。培養(yǎng)后每孔加入CCK-8 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm處吸光值(A450)。以不加細(xì)胞的空白組A450值調(diào)零。

三、BLT1、PGE2、VEGF mRNA檢測(cè)

采用RT-PCR法檢測(cè)。取不同抑制劑培養(yǎng)48 h組和對(duì)照組細(xì)胞，抽提總RNA， RT-PCR法檢測(cè)BLT1、PGE2、VEGF mRNA。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃ 5 min，94℃ 30 s、58℃ 45 s、72℃ 55 s，36次循環(huán)，最后72℃ 7 min。以目的條帶與β-actin條帶灰度值比值作為mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 PCR引物序列

結(jié) 果

一、SW1990細(xì)胞增殖的變化

10 μmol/L MK886或20 μmol/L Celecoxib處理24 h后，SW1990細(xì)胞的增殖受到明顯抑制(P<0.05)，且隨藥物濃度增加，細(xì)胞的增殖抑制更明顯(圖1)。200 μmol/L MK886和80 μmol/L Celecoxib聯(lián)合干預(yù)12 h后，SW1990細(xì)胞的增殖即受到非常明顯的抑制(P<0.01，圖1)。

圖1MK886(a)、Celecoxib(b)和兩者聯(lián)合(c)處理后SW1990細(xì)胞增殖的變化

二、SW1990細(xì)胞BLT1、PGE2、VEGF mRNA表達(dá)的變化

胰腺癌SW1990細(xì)胞均表達(dá)BLT1、PGE2、VEGF mRNA。100μmol/L Celecoxib處理細(xì)胞48 h后，細(xì)胞BLT1、VEGF mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化，但PGE2 mRNA的表達(dá)明顯減少(37.50比71.50，P<0.05)；400 μmol/L MK886或200 μmol/L MK886+80 μmol/L Celecoxib聯(lián)合處理細(xì)胞后，細(xì)胞BLT1、VEGF mRNA表達(dá)明顯減少(40.30、22.75比126.50，P<0.05)，而PGE2 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化(圖2)。

圖2對(duì)照組(1)及Celecoxib(2)、MK886(3)、Celecoxib+MK886(4)處理SW1990細(xì)胞后的BLT1、PGE2、VEGF mRNA表達(dá)

討 論

Eberhart等[1]首先報(bào)道COX2在結(jié)腸癌中的高表達(dá)。將COX2拮抗劑和其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用治療胰腺癌有明顯效果[2]。文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]，結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌及胰腺癌等細(xì)胞株均高表達(dá)5-LOX。在胰腺癌組織中，不僅5- LOX表達(dá)增加，5-LOX的下游代謝產(chǎn)物L(fēng)TB4以及受體的表達(dá)同樣增加，特別是在胰島周?chē)?、?dǎo)管細(xì)胞內(nèi)以及纖維變性組織中，他們推斷LTB4同樣能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖[5-6]。本結(jié)果顯示，MK886及Celecoxib均呈劑量及時(shí)間依賴(lài)性抑制SW1990細(xì)胞的增殖；兩者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抑制作用。

BLT1是LTB4的高親和力G-蛋白耦聯(lián)受體，正常情況下，僅表達(dá)于白細(xì)胞，在胸腺和脾臟上少量表達(dá)。Tong等[6]報(bào)道，LTB4受體拮抗劑LY293111在體內(nèi)外均阻滯胰腺癌細(xì)胞增殖。本結(jié)果顯示，5-LOX拮抗劑MK886抑制SW1990細(xì)胞BLT1 mRNA的表達(dá)，而不影響PGE2 mRNA表達(dá)；COX2拮抗劑Celecoxib抑制SW1990細(xì)胞PGE2 mRNA表達(dá)，而不影響B(tài)LT1 mRNA表達(dá)，提示當(dāng)阻斷5-LOX代謝途徑時(shí)，COX2途徑無(wú)明顯變化。因此5-LOX代謝途徑與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系更為密切。

VEGF是刺激腫瘤血管生長(zhǎng)的最主要因子。文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道，COX2/PGE2系統(tǒng)在腫瘤血管生成中起重要作用。本結(jié)果顯示，Celecoxib對(duì)VEGF mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響，而MK886、MK886和Celecoxib的聯(lián)合干預(yù)則抑制VEGF mRNA的表達(dá)。

總之，通過(guò)阻斷花生四烯酸代謝的兩條途徑均可抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖，其中5-LOX代謝途徑可能起主要作用，而同時(shí)阻斷兩條途徑能更顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，為臨床胰腺癌的治療提供新的思路。

[1] Eberhart CE, Coffey RJ, Radhika A, et al. Up-regulation of cyclooxygenase 2gene expression in human colorectal adenomas and adenocarcinomas.Gastroenterology, 1994,107: 1183-1188.

[2] Ferrari V, Valcamonico F, Amoroso V, et al.Gemcitabine plus celecoxib (GECO) in advanced pancreatic cancer: a phase Ⅱ trial. Cancer Chemother Pharmacol,2006,57:185-190.

[3] Hong SH, Avis I, Vos MD, et al. Relationship of arachidonic acid metabolizingenzyme expression in epithelial cancer cell lines to the growth effect of selective biochemicalinhibitors. Cancer Res, 1999, 59: 2223-2228.

[4] Ding XZ, Iversen P, Cluck MW, et al. Lipoxygenase inhibitors abolish proliferation of human pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun,1999,261:218-223.

[5] Hennig R, Ding XZ, Tong WG, et al.5-Lipoxygenase and leukotriene B4 receptor areExpressed in human pancreatic cancers but not in pancreatic ducts in normal tissue. Am J Pathol,2002,161:421-428.

[6] Tong WG,Ding XZ,Hennig R,et al.Leukotriene B4 receptor antagonist Ly293111 inhibits proliferation and induces apoptosis in human pancreatic cancer cells.Clin Cancer Res,2002,8:3232-3242.

[7] Eibl G, Takata Y, Boros LG, et al.Growth stimulation of COX-2-negative pancreatic cancer by a selective COX-2 Inhibitor, Cancer Res, 2005, 65: 982-990.

[8] Amano H, Hayashi I, Endo H, et al. Host prostaglandinE(2)-EP3 signaling regulates tumor-associatedangiogenesis and tumor growth. J Exp Med,2003,197:221-232.

2011-03-22)

(本文編輯：屠振興)

InhibitoryeffectofMK886andcelecoxibonthegrowthofpancreaticcancercelllineSW1990andangiogenesis

ZHOUGuo-xiong,ZHUChen,DINGXiao-ling,ZHANGHai-feng,ZHANGHong,CAOWei,QiIANGHuai,XUZheng-fu.

DepartmentofGastroeterology,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China

ZHOUGuo-xiong,Email：zhouguoxiong@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the effects of two inhibitors of arachidonic acid metabolic pathway (5-cyclooxygenase blockade MK886 and COX 2 blockade celecoxib) on growth and VEGF mRNA expression of human pancreatic cancer cell SW1990.MethodsPancreatic cancer cells SW1990 were cultured with different concentrations of MK886, celecoxib, MK886 and celecoxib, then the cell proliferation was detected by using CCK-8, BLT1 mRNA, PGE2 mRNA and VEGF mRNA expressions were determined by RT-PCR.ResultsAfter 10 μmol/L MK886 or 20 mmol/L celecoxib treatment for 24 h, the growth of SW1990 was greatly suppressed (1.80±0.06vs1.65±0.10, 2.04±0.03vs1.86±0.02,P<0.01), and the growth suppression of SW1990 cells was increased accompanying the raised concentration of MK886 or celecoxib. After both MK886 and celecoxib treatment for 12 h, the growth of SW 1990 cells was much obviously suppressed (1.72±0.05vs1.52±0.05,P<0.01).After celecoxib treatment for 48 h, the BLT1 mRNA, PGE2 mRNA and VEGFmRNA expressions were not significantly changed, but the expressions of PGE2 mRNA were significantly decreased (P<0.05). After MK886 or MK886+celecoxib treatment, the expressions of BLT1 mRNA, VEGF mRNA were significantly decreased (P<0.05), but the expressions of PGE2 mRNA were not significantly changed when compared to control group.ConclusionsTwo metabolic pathways of arachidonic acid have a close relation with occurrence and proliferation of pancreatic cancer, when both of the pathways were blocked, the proliferation of the pancreatic cancer cell was suppressed obviously.

Pancreatic neoplasms; MK886; Celecoxib； 5-Lipoxygenase; Cyclooxygenase

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.009

江蘇省自然科學(xué)基金(BK2004049)，江蘇省重點(diǎn)醫(yī)學(xué)人才基金(RC2007085)

226001 江蘇南通，南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

周?chē)?guó)雄，Email：zhouguoxiong@ medmail．com．cn