李嘉 劉爽 孫海晨 崔葉青 李非

·論著·

胰腺纖維化后結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)及意義

李嘉 劉爽 孫海晨 崔葉青 李非

目的觀察胰腺纖維化后結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor ，CTGF)在胰腺組織內(nèi)的表達(dá)，探討其意義。方法通過(guò)高脂飼料誘導(dǎo)大鼠胰腺纖維化模型，16周后處死大鼠，取胰腺組織常規(guī)病理檢查，天狼猩紅染色和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)胰腺纖維化組織膠原蛋白Ⅰ、α-SMA及CTGF蛋白表達(dá)。結(jié)果胰腺纖維化后，胰腺小葉和腺泡萎縮，小葉間隙增寬，間質(zhì)內(nèi)纖維組織明顯增生；胰腺組織內(nèi)膠原蛋白Ⅰ的合成較正常胰腺明顯增加(1207.3±115.5比166.7±78.4，P<0.01)，α-SMA表達(dá)量較正常胰腺組織增高(1500.2±255.8比57.4±23.2，P<0.01)，CTGF表達(dá)較正常胰腺明顯增加( 2950.5±431.9比382.2±190.8，P<0.01)，且胰腺星狀細(xì)胞(PSCs)大量活化。結(jié)論CTGF是胰腺纖維化的重要作用因子，其作用與PSCs活化密切相關(guān)。

胰腺； 纖維化； 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子； 星形細(xì)胞

胰腺纖維化是慢性胰腺炎(CP)典型的組織病理學(xué)特征，主要表現(xiàn)為胰腺組織中有過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積[1]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor, CTGF)是一種富含半胱氨酸的分泌多肽, 表達(dá)于多種組織器官。大量研究表明，CTGF是重要的促組織纖維化蛋白，可經(jīng)自分泌及旁分泌兩種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移及ECM合成[2]。體外研究表明，在胰腺纖維化進(jìn)程中起核心作用的胰腺星狀細(xì)胞(PSCs)能夠表達(dá)CTGF基因[3]。給予外源性CTGF會(huì)導(dǎo)致PSCs的增殖、遷移[4]。但在纖維化的胰腺組織內(nèi)CTGF表達(dá)及其與PSCs的關(guān)系，目前尚罕見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察胰腺纖維化大鼠胰腺組織CTGF的表達(dá)，探討其意義。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性SD大鼠12只，體重200～300 g，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華公司。按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組和纖維化組，各6只。對(duì)照組以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，纖維化組動(dòng)物以高脂飼料喂養(yǎng)[5]。大鼠飼養(yǎng)16周，經(jīng)麻醉后腹部正中切口入腹，迅速切取胰腺組織，10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋。

二、方法

1．胰腺組織病理檢查：常規(guī)HE染色，光鏡下檢查。

2．膠原蛋白Ⅰ表達(dá)檢測(cè)：采用天狼猩紅染色，具體步驟參照本實(shí)驗(yàn)室以往方法[5]。即切片脫蠟水化后置入天青石藍(lán)液染6 min，蒸餾水洗3次后置入天狼猩紅飽和苦味酸液染15 min，無(wú)水乙醇直接分化與脫水,光鏡下觀察胰腺組織中膠原蛋白沉積部位。Ⅰ 型膠原纖維呈紅色,細(xì)胞核呈綠色，其余呈黃色。

3．α-SMA與CTGF蛋白檢測(cè)：采用常規(guī)免疫組化染色方法。小鼠抗人α-SMA單抗購(gòu)自福州邁新公司，兔抗大鼠CTGF多抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。細(xì)胞胞質(zhì)和(或)胞膜呈棕褐色且背景清晰者為陽(yáng)性，反之為陰性。

4．結(jié)果判斷：在200倍光鏡下隨機(jī)全盲選取5個(gè)視野,攝片后用Image Pro-plus 6.0圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域的積分光密度值(integrated optical density，IOD)和特定區(qū)域內(nèi)的平均光密度值(average optical density，AOD)，評(píng)價(jià)其表達(dá)量及表達(dá)強(qiáng)度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺組織學(xué)改變

對(duì)照組大鼠胰腺組織無(wú)明顯病理變化。纖維化組大鼠胰腺小葉和腺泡萎縮，小葉間隙增寬，間質(zhì)內(nèi)纖維組織明顯增生(圖1)；天狼猩紅染色見間質(zhì)內(nèi)血管、導(dǎo)管及胰島周圍膠原纖維增生明顯，部分破壞和萎縮的腺泡結(jié)構(gòu)以及胰島被膠原纖維穿插、包繞，呈結(jié)節(jié)狀纖維化(圖2)。纖維化組大鼠胰腺組織膠原蛋白Ⅰ的含量為1207.3±115.5，較對(duì)照組的166.7±78.4顯著增加(P<0.01)。

二、胰腺組織α-SMA表達(dá)的變化

對(duì)照組α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞僅見于小葉間隔中較大的脈管壁，而胰腺小葉內(nèi)沒有α-SMA表達(dá)。纖維化組腺泡周圍，尤其是包繞于脈管、腺泡和胰島周圍的增生纖維組織中可見大量α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，呈星形、梭形或橢圓形等形態(tài)，部分細(xì)胞可伸出較長(zhǎng)的胞質(zhì)突觸，包繞在腺泡周圍(圖3)。纖維化組胰腺α-SMA表達(dá)量為1500.2±255.8，顯著高于對(duì)照組的57.4±23.2(P<0.01)。

三、胰腺組織CTGF表達(dá)的變化

對(duì)照組胰腺在鄰近小葉間隙的腺泡細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞有CTGF的弱表達(dá)，其他區(qū)域無(wú)CTGF表達(dá)。纖維化組胰腺在纖維組織增生的區(qū)域可見大量明顯表達(dá)CTGF的細(xì)胞，位于腺泡周圍及增生的膠原纖維中，在胰島細(xì)胞、腺泡細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞也有CTGF較弱的表達(dá)(圖4)。纖維化組胰腺組織內(nèi)CTGF表達(dá)量為2950.5±431.9，顯著高于對(duì)照組的382.2±190.8(P<0.01)。

圖1對(duì)照組(a)與纖維化組(b)的胰腺組織學(xué)改變(HE ×200)

圖2對(duì)照組(a)與纖維化組(b)胰腺組織膠原蛋白Ⅰ的表達(dá)(天狼猩紅染色 ×200)

圖3對(duì)照組(a)與纖維化組(b)胰腺組織α-SMA的表達(dá)(免疫組化 ×200)

圖4對(duì)照組(a)與纖維化組(b)胰腺組織CTGF的表達(dá)(免疫組化 ×200)

討 論

胰腺纖維化是由不同原因?qū)е碌腃P典型的組織病理學(xué)特征，為組織中有過(guò)量的ECM沉積，主要成分是膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ。胰腺纖維化另一個(gè)典型的特征是纖維化的胰腺組織內(nèi)有大量活化的PSCs。PSCs活化的標(biāo)志是α-SMA陽(yáng)性[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠胰腺組織內(nèi)有大量的膠原蛋白Ⅰ沉積，有大量α-SMA陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，即活化的PSCs?；罨腜SCs隨后大量合成ECM蛋白、黏附因子以及趨化因子等物質(zhì)。

CTGF是CCN家族的成員之一，C端富含半胱氨酸的分泌多肽[2]，廣泛分布于多種組織器官，如心臟、肺、肝、腎、胰腺、胎盤及結(jié)締組織中。大量研究表明，CTGF是重要的促組織纖維化蛋白，主要功能為：(1)作為TGF-β的下游因子，促進(jìn)腎成纖維細(xì)胞的有絲分裂[7]；(2)促進(jìn)多種ECM成分如蛋白多糖、膠原蛋白以及纖維連接蛋白、層黏蛋白的產(chǎn)生，抑制降解ECM的酶類活性，抑制ECM的降解[8]；(3)促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表達(dá)α-SMA的成肌纖維細(xì)胞[9]；(4)促進(jìn)成纖維細(xì)胞向纖維連接蛋白黏附[10]；(5)增加血管平滑肌細(xì)胞的遷移率[11]；⑥促進(jìn)血管形成[12]。

在正常胰腺組織，胰島細(xì)胞和一些小的胰管上皮細(xì)胞可以表達(dá)CTGF，在重癥急性胰腺炎的胰腺組織內(nèi)，腺泡細(xì)胞也能夠表達(dá)CTGF，腺泡細(xì)胞所表達(dá)的CTGF對(duì)于參與胰腺組織修復(fù)的細(xì)胞起到了旁分泌的調(diào)控作用[13]。本結(jié)果顯示，胰腺纖維化組織內(nèi)CTGF的表達(dá)明顯高于正常胰腺組織，提示CTGF在胰腺纖維化的過(guò)程中起重要作用。進(jìn)一步觀察顯示，CTGF顯著表達(dá)于一些位于胰腺腺泡周圍和小葉間隙內(nèi)增生的膠原纖維中的細(xì)胞。通過(guò)與α-SMA的免疫組化染色比較，可以判斷這些顯著表達(dá)CTGF的細(xì)胞就是活化的PSCs。且PSCs的CTGF表達(dá)要明顯高于腺泡細(xì)胞等胰腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，提示活化的PSCs可能是纖維化的胰腺組織內(nèi)CTGF的主要來(lái)源。另一方面，CTGF在活化PSCs的強(qiáng)表達(dá)也提示PSCs活化后，CTGF對(duì)PSCs的調(diào)控作用主要是以自分泌作用為主。

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2010-07-26)

(本文編輯：屠振興)

Expressionofconnectivetissuegrowthfactorinfibroticpancreas

LIJia,LIUShuang,SUNHai-chen,CUIYe-qing,LIFei.

DepartmentofGeneralSurgery,XuanwuHospitalCapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China

LIFei,Email:feili36@ccmu.edu.cn

ObjectiveTo observe the expression of connective tissue growth factor (CTGF) in pancreas, and discuss its significance.MethodsThe pancreatic fibrosis model was induced by high fat diets. The rats were sacrificed 16 weeks later, and the pancreatic tissue was harvested for routine pathologic examinations. Pancreatic collagen fibrosis I was determined by HE and Sirius red staining;α-SMA and CTGF expression were detected by immunohistochemistry.ResultsAfter pancreatic fibrosis, pancreatic lobules and acinar atrophy was observed, lobules gap was widened, interstitial fibrous tissue was significantly proliferated, the synthesis of pancreatic collagen fibrosis I was significantly increased when compared with normal pancreas (1500.2±255.8vs. 57.4±23.2,P<0.01), the expression of α-SMA was significantly increased when compared with normal pancreas(1500.2±255.8vs. 57.4±23.2,P<0.01), and the expression of CTGF was significantly increased when compared with normal pancreas (2950.5±431.9vs. 382.2±190.8,P<0.01), and there were abundant activated PSCs.ConclusionsCTGF participated in the regulation of pancreatic fibrosis development; the function of CTGF was closely related to PSCs activation.

Pancreatic; Fibrosis; Connective tissue growth factor; Astrocytes

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.015

100053 北京，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院普通外科(李嘉、李非)，外科實(shí)驗(yàn)室(劉爽、孫海晨、崔葉青)

李非， Email:feili36@ccmu.edu.cn